SISTEMAS MICELARES DE DUAS FASES AQUOSAS

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1 SISTEMAS MICELARES DE DUAS FASES AQUOSAS

2 grupo liofóbico grupo liofílico
TENSOATIVOS E MICELAS Moléculas anfifílicas: grupo liofóbico grupo liofílico cauda apolar cabeça polar IÔNICOS: brometo de dodeciltrimetilamônio CH3 CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-N-CH3+ Br- dodecil sulfato de sódio CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OSO3- Na+ Catiônicos  Aniônicos 

3 TENSOATIVOS E MICELAS NÃO-IÔNICOS:
CH3-(CH2)9-OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OH óxido de n-deciltetraetileno (C10E4) ZWITERIÔNICOS: CH-CH2-PO4--(CH2)2-N(CH3)3+ dioctanoil fosfatidil colina (C8-lecitina) QUANTO À CAUDA: CH3-(CH2)6-COOCH CH3-(CH2)6-COOCH Saturada/insaturada Cadeias duplas Cadeia ramificada halogenadas (fluorcarbonetos) cadeia de polióxido de propileno

4 Lisina (zweterion)

5 SURFACTANT = Surface Active Agent
Líquidos  contração da superfície (< energia livre) força de atração para dentro exercida pelas moléculas presentes na solução sobre as moléculas na superfície TENSÃO SUPERFICIAL - g (mN/m) Moléculas anfifílicas – procuram orientar-se na superfície (< energia livre) Interação H2O-Tens. < interação H2O-H2O tensão superficial

6 MICELAS = agregados de tensoativos mínimo de energia livre
Micelização = mecanismo alternativo à adsorção na superfície/interface para a remoção do grupo hidrofóbico do contato com a água. Formação de micelas  balanço complexo de forças intermoleculares: eletrostáticas ligações de hidrogênio van der Waals hidrofóbicas estéricas Razão principal para a formação de micelas = obtenção de estado mínimo de energia livre

7 As micelas são colóides de associação
pressão osmótica detergência condutividade tensão superficial CMC Concentração de tensoativo As micelas são colóides de associação Dinâmicas, reversíveis, distribuição estatística de tamanhos (polidispersão)

8 TIPOS DE AGREGADOS FORMADOS (MICELAS)
micela cilíndrica micela esférica vesícula (lipossoma) bicamada

9 “Solução” micelar homogênea
- turvação  “cloud point” - “ponto de névoa” - aumento da temperatura  redução na solubilidade da micela temperatura SEPARAÇÃO DE FASES Fase rica em micelas Fase pobre em micelas “Solução” micelar homogênea

10 Extração Líquido-Líquido em Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas
PROCESSO DE SEPARAÇÃO DE FASES Fase Pobre em micelas >> TºC tempo Fase Rica em micelas Sistema Monofásico Sistema Bifásico

11 SISTEMA MICELAR DE DUAS FASES AQUOSAS

12 CURVA BINODAL (C10E4) Cc e Vc Cd e Vd Concentração de tensoativo Cd Cc
T (oC) Temperatura T´ Cc e Vc Cd e Vd (ou vice-versa)

13 Adalberto Pessoa Junior - Extração Líquido-Líquido de Biomoléculas
Extração Líquido-Líquido em Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas - SMDFA DIAGRAMA DE FASES Yagui, C. O. R., Pessoa A., Blankschtein, d. Two- phase aqueous micellar systems - an alternative method for protein purification. Brazilian Journal of Chemical Engineering. 21(4): , 2004

14 Influência de alguns sais sobre o ponto crítico
19,00 13,05 C10E4 + 0,5 M Li2SO4 C10E4 + 0,5 M NaCl C10E4 C10E4 + 0,1 M KI 23,60 4,75

15 SMDFA – aplicações: Purificar e concentrar compostos como: BSA, bacteriófagos, antibióticos, colesterol oxidase, lisozima e outras enzimas, vitaminas lipossolúveis e compostos orgânicos. Separar contaminantes com características hidrofóbicas presentes em soluções biológicas. Primeiro trabalho - BORDIER (1981) - agente tensoativo não-iônico Triton X proteínas hidrofílicas X proteínas hidrofóbicas. Pode ser aplicado a sistemas envolvendo células intactas. Alternativa na purificação de proteínas de plantas - compostos presentes em plantas que interferem nas técnicas convencionais de extração, como fenóis e clorofila, podem ser facilmente removidos por SMDFA. Pode separar: íons metálicos, estriol, progesterona, -estradiol, estrona, clorofila, bacteriófagos, células, fenóis e outras moléculas orgânicas de baixa massa molar.

16 SISTEMA MICELAR DE DUAS FASES AQUOSAS (SMDFA) APLICADO À PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Ambiente ameno para materiais biológicos; Método seguro, não utiliza compostos inflamáveis ou explosivos; Fácil ampliação de escala; Baixo custo (em princípio requer somente um tensoativo e em baixas concentrações); Gera resíduos de fácil manuseio (baixa toxicidade, fácil acondicionamento, etc.);

17 Micelas fornecem ambientes hidrofílicos e hidrofóbicos;
Controle e otimização da partição através do ajuste das características micelares (tamanho e forma); Fácil separação do material desejado das moléculas de tensoativo após a purificação; A seletividade da partição pode ser melhorada com a utilização de micelas contendo ligantes de afinidade ou misturas de tensoativos; Técnica não interfere em metodologias como cromatografia líquida, eletroforese, ELISA, etc.

18 SISTEMA MICELAR NÃO-IÔNICO DE DUAS FASES AQUOSAS PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Altos valores de Kp proteína hidrofílica proteína hidrofóbica BORDIER (1981)  apresentou a possibilidade de separação de proteínas em SMDFA – tensoativo Triton X-114. Purificação de proteínas hidrofóbicas: colesterol oxidase, lipase, proteínas de membrana.

19 PARTIÇÃO DA ENZIMA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE (G6PD) EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO

20 SISTEMA MICELAR MISTO (NÃO-IÔNICO/IÔNICO) DE DUAS FASES AQUOSAS
ou Micelas mistas são formadas in situ, sem necessidade de síntese como os polímeros + eletrólitos Condições da solução (pH, FI) podem ser variadas melhorar a partição alterando as interações eletrostáticas e de volume de exclusão Reverter as interações e separar as proteínas das micelas

21 TENSOATIVOS CATIÔNICOS X DESNATURAÇÃO PROTÉICA
2.5 mM CnTAB mg/mL G6PD Recuperação Tempo

22 TENSOATIVOS X DESNATURAÇÃO PROTÉICA
Tensoativos não-iônicos – apresentam apenas interações hidrofóbicas não-específicas em concentrações ~ CMC (exceção: BSA e Tritons) Tensoativos iônicos: 1- interações eletrostáticas com resíduos de aminoácidos de carga oposta na superfície da proteína (ligação sítio-específica) 2- interações hidrofóbicas das caudas apolares com o interior apolar da proteína (ligação cooperativa, não-específica). maior a tendência a formar micelas - maior a afinidade pelas proteínas em geral, tensoativos aniônicos interagem mais fortemente que os catiônicos cadeias laterais da arginina e lisina (ligação com aniônico) são mais “projetadas” que as do ác. glutâmico e aspartato (ligação com catiônicos)

23 PURIFICAÇÃO DE G6PD EM HOMOGENEIZADO DE S. Cerevisiae
SISTEMA I C10E4/Tampão separação de fases coleta da fase Inferior SISTEMA II C10E4/C10TAB/Tampão

24 + EXTRAÇÃO DA PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE GFPuv
UTILIZANDO LIGANTE DE AFINIDADE Surfactant - C10G1 (Decyl -D-glucopyranoside) + GFP CBM9 liga à celulose, di- e monossacarídeos CBM9 GFP C10G1

25 C10G1 (5%) Lisado Celular + CBM9-GFP Tampão pH 7,2
Micela + ligante + GFP 29oC, após 6h Fase Pobre em Micelas Fase Rica em Micelas (GFPuv) C10G1 (5%) Lisado Celular + CBM9-GFP Tampão pH 7,2

26 UTILIZAÇÃO DE INIBIDORES ENZIMÁTICOS COMO LIGANTES DE AFINIDADE
Procion red Cibacron blue Inibidores de G6PD - Mimetizam a coenzima NAD(P)+ NADP+

27 PARTIÇÃO DOS LIGANTES CIBACRON BLUE E PROCION RED EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO

28

29 PARTIÇÃO DA G6PD EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO CONTENDO CIBACRON BLUE E PROCION RED
Ocorrência de interação do ligante com as micelas, diminuindo a probabilidade de formação de complexo enzima inibidor. Interações de afinidade não são suficientemente fortes para influenciar significantemente o perfil de partição da G6PD.

30 Estrutura da Endotoxina: LipoPoliSsacarídeo (LPS)
porção hidrofílica 4-(C8H17)-C6H4-(OCH2CH2)n-OH,n~8 porção hidrofóbica Estrutura da Endotoxina: LipoPoliSsacarídeo (LPS) TRITON X-114 polioxietileno p-t-octil fenol Remoção de Endotoxina (pirogênio) por Extração Líquido-Líquido

31 Adalberto Pessoa Junior - Extração Líquido-Líquido de Biomoléculas
Comportamento da GFPuv ( ) e do LPS ( ) na Extração em SMDFA Utilizando Triton X-114 ( ) Tubo visto a olho nu Tubo em câmara de luz UV