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PublicouRachel Bayer Aragão Alterado mais de 8 anos atrás
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Introdução a Enzimologia e Processos fermentativos
Msc J.Gabriel Roderjan Aula 1 e 2 – Farmácia 8ºP 2009
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Plano de Trabalho PROGRAMA TEÓRICO:
Plano de trabalho Apresentação da bibliografia; sorteio dos seminários Introdução e Histórico; catálise; atividade enzimática; cinética enzimática; Aplicação clínica das enzimas; Microrganismos e Enzimas de importância aos processos fermentativos Obtenção de enzimas e produtos de digestão enzimática Introdução aos processos fermentativos Seminários: Fermentação alcoólica: Aguardentes e outras bebidas Seminários: Fermentação acética: vinagres Seminários: Fermentação alcoólica: cervejas e vinhos Seminários: Fermentação láctica: vegetais Seminários: Fermentação láctica: leite e derivados Seminários: Fermentação láctica: pescados e ensilados Seminários: Processos biotecnológicos
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Apresentação dos tópicos Leitura de bibliografia Discussão dos tópicos
Aula teórica Apresentação dos tópicos Leitura de bibliografia Discussão dos tópicos Perguntas
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Plano de Trabalho PROGRAMA PRÁTICO:
Plano de trabalho de aulas práticas; Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos Obtenção, caracterização e quantificação de enzimas; Biorreatores e transferência de oxigenio em biorreatores Imobilização de enzimas Purificação de enzimas Preparação para fermentação láctica do leite Fermentação láctica: leite Preparação para produção de cerveja Fermentação alcoólica: cervejas
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Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos
Tutorial Formulação de protocolos de procedimento; Formulação do plano de ação; Check-list; Documentação e legislação Procedimento operacional padrão Resultados e modificações
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AVALIAÇÕES AULAS PRÁTICAS Avaliação de desempenho nas aulas práticas
AULAS PRÁTICAS Avaliação de desempenho nas aulas práticas Trabalhos em sala de aula Valor 2,0 PROVAS 1ª prova 1° bimestre - 09/09/ valor 8,0 2ª prova 1°bimestre - 07/10/ valor 8,0 3ª prova 2°bimestre - 04/11/ valor 5,0 4ª avaliação - relatório aulas práticas 2°bimestre - 02/12/ valor 10,0 Provas de 10 à 15 questões, com 1 à 3 questões discursivas SEMINÁRIOS Trabalho impresso Apresentação Valor 5,0
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Bibliografia LEHNINGER, Albert L.; NELSON, David L.; COX, Michael M. Lehninger princípios de bioquímica. 4. ed. São Paulo: Sarvier, xxviii, 1202 p. ISBN (enc.) ALBERTS, Bruce. Fundamentos da biologia celular. Porto Alegre: ArTmed, v. (várias paginações) ISBN BRUCHMANN, Ernest-Erich. Bioquímica técnica: Ernst-Erich Bruchmann ; traducido por Aurora Perez Torrome. Zaragosa: Acribia, p. ISBN LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio; BORZANI, Walter. Tecnologia das fermentações. São Paulo: E. Blücher, c p. AQUARONE, Eugênio; LIMA, Urgel de Almeida; BORZANI, Walter. Alimentos e bebidas produzidos por fermentação. São Paulo: E. Blücher, p. (Biotecnologia ; v. 5) CARVALHO, Geraldo Camargo de. Aulas de quimica. São Paulo: Nobel, 1979.v.1 CRUEGER, Wulf; CRUEGER, Anneliese. Biotecnología: manual de microbiología industrial. Zaragosa: Acribia, p. ISBN BORZANI, Walter; LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio. Engenharia bioquímica. São Paulo: E. Blücher, p. (Biotecnologia ; v. 3) AMORIM, Henrique Vianna de; LEÃO, Regina Machado. Fermentação alcoólica: ciência e tecnologia. Piracicaba: Fermentec, xv, 434 p. ISBN (enc.) WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de los enzimas. Zaragosa: Acribia, p. ISBN
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Modelo de relatório de seminário
SUMÁRIO Introdução Aplicação Método (como se utiliza e quais vias bioquímicas envolvidas) Organograma (seqüência de eventos) Legislação e Controle de qualidade Referências Anexos
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Aspectos gerais
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Vida= fn(matéria x energia)
Fn é a transformação de partículas, átomos e moléculas; Reações químicas Estabilidade Conversão da matéria em energia e da energia em matéria Fonte principal: Sol Meio: água
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Reações químicas DG = - RT ln Keq A + B ↔ AB AOH + HB ↔ AB +H2O S P
Relação entre a constante de equilíbrio e a variação de energia livre de uma reação S P Reação: Keq = [P]/[S] DG = - RT ln Keq Reações com DG’ grande e negativo significa que o equilíbrio é favorável à formação dos produtos
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S P Reação = colisão de moléculas em uma determinada orientação com uma quantidade definida de energia denominada ΔG (energia de ativação do estado de transição ou energia livre de ativação)
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Facilitadores de reação
Catálise = alteração na velocidade da reação William P. Jencks, article in Advances in Enzymology, 1975 Redução na energia de ativação (ΔG); Sem um catalisador : A + B ↔ AB em 20 minutos e X de ΔG Com um catalisador : A + B ↔ AB em 20 milésimos de segundo e X/5 de ΔG
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Tabela da relação entre constante de equilíbrio e energia livre de ativação ΔG
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A lei de velocidade A velocidade de uma reação e a energia de ativação
a) Reação de 1ª ordem: V = k [S] (uni molecular) b) Reação de 2ª ordem: V = k [S1][S2] k M-1 S-1 (bi molecular) Obs. uma pequena diminuição na energia de ativação, corresponde a um grande aumento na velocidade da reação
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Vantagem da catálise Reação com vários passos: velocidade é determinada pelo passo com a mais alta ∆G++ Energia de ativação: barreira energética para as reações químicas. Seletividade celular: reações necessárias para sobrevivência da célula: ∆G++ menores;
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Quem faz a catálise? Catalisador = qualquer molécula que facilite a reação. Participa da reação, mas ao final é recuperado de forma a não ser alterado nem consumido na reação. Os reagentes e o catalisador encontram-se na mesma fase, geralmente é líquida; A reação evolui através de espécies intermédios com menor energia de ativação; A reação tem mais do que um passo. E + S ES EP E + P
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Tipo de catálise
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Biomoléculas e a catálise
Carboidratos Lipídeos Proteínas
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Proteínas funcionais Seqüência amino acídica é quase infinita
Combinação de 20 aminoácidos sem limite de número e repetições Formação estrutural multivariável Adaptação a vários estados e ambientes
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Enzimas = Proteínas funcionais
Proteínas altamente especializadas com extraordinário poder catalítico.
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O Estado de Transição de produto e substrato na ausência de um catalisador ou enzima.
As enzimas reduzem a energia de ativação sem alterar a constante de equilíbrio acelerando o processo da reação.
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O que há de especializado na função da enzima?
Alto grau de especificidade pelo substrato; Aceleram as reações; Atividade depende da temperatura, pH, substrato, co-fatores e produto; São as principais responsáveis para cada processo bioquímico: catabolismo e Anabolismo
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O que confere a enzima catalisar reações bioquímicas?
Estrutura especializada voltada ao substrato A forma complementar, carga e características hidrofílicas/hidrofóbicas, são responsáveis por esta especificidade.
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Catálise enzimática
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O Ajuste Induzido Mudança conformacional na hexoquinase induzida pela ligação da glicose em seu sítio ativo, faz com que a enzima seja ativada.
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A Enzima é Complementar a seu Substrato no Estado de Transição
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História da Enzimologia
Pasteur declarou que "a fermentação alcoólica é um ato correlacionado com a vida e organização das células do fermento (levedura), e não com a sua morte ou putrefação". Enzima – do grego ενζυμον, “levedar” ou fermentar – Kuhne 1878; Buchner provou que extratos de levedura tinham a capacidade de fermentar
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Histórico Sumner provou que as enzimas eram proteínas através da cristalização da urease – 1926; John Northrop e Wendell Meredith Stanley confirmaram as enzimas como proteínas pelo estudo da tripsina, quimotripsina e pepsina – 1930. Próximo passo é o estudo da catálise enzimática ao nível quântico.
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Especificidade Eficiência
Ação da enzima no substrato é dependente de: Presença de substrato em concentração adequada; pH Temperatura Concentração de produto; Cofatores Meio (sólido ou líquido)
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COFATORES necessários para o funcionamento da enzima
Coenzima: quando o cofator não se liga covalentemente à enzima Grupo prostético: quando o cofator se liga covalentemente à enzima Holoenzima: enzima + cofator (enzima cataliticamente ativa) Apoenzima ou apoproteína: refere-se somente a parte protéica da enzima As enzimas reguladas por modificações não-covalentes são chamadas de alostéricas.
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Cofatores inorgânicos: íons
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A Catálise Enzimática e o Complexo Enzima-Substrato
Quimiotripsina O centro ativo: região da enzima onde ocorre a catálise Sítio ativo – porção da estrutura protéica da enzima onde liga-se o substrato
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Coenzimas
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Nome comum da enzima: Hexoquinase
ATP GLICOSE ADP GLICOSE-6-FOSFATO Nome comum da enzima: Hexoquinase Nome sistemático: ATP:Glicose fosfotransferase Classificação: E.C
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ATP:Glicose fosfotransferase
E.C [EC number]: número de comissão da enzima 2 transferase 7 sub-classe: fosfotransferase 1 grupo hidroxil (como grupo aceptor) 1 D- glicose que aceita o grupo fosforil. Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular.
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Nomenclatura das enzimas
ATP:Glicose fosfotransferase E.C [EC number]: número de comissão da enzima 2 transferase 7 sub-classe: fosfotransferase 1 grupo hidroxil (como grupo aceptor) 1 D- glicose que aceita o grupo fosforil. Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular.
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Cinética enzimática
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Efeito da Concentração do Substrato na Velocidade Inicial de uma Reação Enzimática
[E] = constante e limitante Equação de Michaelis-Menten
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Quando [S] tende a zero (reação de 1ª ordem) Quando [S] tende para infinito (reação de ordem zero) Constante de Michaelis-Menten (Km) É a concentração do substrato [S], quando Vo = Vmax/2
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A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
k k2 Modelo Cinético: E + S ES E + P k K-2 Aproximações: Admitindo-se a reação em seu início: k k2 E + S ES E P k-1 2. Considerando-se a segunda etapa como passo limitante, tem-se que a velocidade inicial da reação (Vo) é dada por: Vo = k2 [ES] (eq. 1)
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Vf = k1 [EL][S] ou Vf = k1 ([ET] – [ES]) [S] (eq. 2)
A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN 3. Considera-se que a concentração de S é muito maior que a de enzima e despreza-se a quantidade de substrato complexada com a enzima, em relação à concentração total de substrato Note que, numa reação enzimática, a enzima se encontra na forma livre (EL) e na forma complexada com o substrato (ES), daí: [EL] = [ET] - [ES] 4. Considerando-se estado estacionário, a concentração de ES permanece constante, ou seja, a velocidade de sua formação (Vf) é igual à de seu desaparecimento (Vd) Vf = k1 [EL][S] ou Vf = k1 ([ET] – [ES]) [S] (eq. 2) Vd = k2 [ES] + k-1 [ES] ( eq. 3)
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A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
Igualando a eq. 2 com a eq. 3 e rearranjo os termos, temos: [ET] [S] [ES] = (eq. 4) [S] + Km onde, Km = (k-1+k2)/k1 (Constante de Michaelis-Menten) Combinando a eq. 1 com a eq. 4, temos: k2[ET] [S] Vmax [S] Vo = ou Vo = [S] + Km [S] + Km
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Modo mais correto de se determinar Vmax e Km
O gráfico de 1/vo x 1/[S] A forma dos inversos da equação de Michaelis-Menten ou equação de Lineweaver-Burk Modo mais correto de se determinar Vmax e Km
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O significado de Km e a afinidade enzimática
Se k2 << k-1, tem-se que Km = k-1/k1 e, portanto a constante de dissociação do complexo ES
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Reações que ocorrem em várias etapas em que o passo EP E + P é o limitante
Passo limitante kcat = k3 e [EP] ~[Et] kcat é denominado de número de renovação: equivale ao n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única enzima em uma dada unidade de tempo, quando a enzima está saturada com o substrato
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A Relação kcat/Km Para [S] << Km Vo depende da concentração de dois reagentes e o termo kcat/Km é um constante de 2ª ordem. É considerado o melhor parâmetro cinético para comparar eficiência catalítica
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Reações com Dois ou Mais Substratos
(Mecanismo de dupla troca ou pingue-pongue)
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Cinética envolvendo um complexo ternário
Cinética de dupla troca ou pingue-pongue
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Inibição Reversível a) Inibição Competitiva
KI é a constante de dissociação do complexo EI
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Cinética de uma Inibição Competitiva
EI E + I KI é a constante de dissociação do complexo EI
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Inibidor Competitivo Não altera a velocidade máxima da reação, porém aumenta a constante de Michaelis-Menten ou seja: V’max = Vmax K’m > Km Admitindo-se que o inverso de Km represente a afinidade enzimática, pode afirmar que este inibidor diminui a afinidade da enzima pelo substrato Inibição competitiva pode ser revertida por aumentos na concentração do substrato
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b) Inibição não-competitiva
K’I é a constante de dissociação do complexo ESI
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Cinética de uma Inibição não -competitiva
ESI ES + I K’I é a constante de dissociação do complexo ESI
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Inibidor não-competitivo
Diminui a velocidade máxima da reação e a constante de Michaelis-Menten ambos por um mesmo valor (a’): V’max < Vmax K’m < Km Note que independentemente do valor de a’ o coeficiente angular da reta 1/Vo x 1/[S] será sempre o mesmo, daí as retas serem paralelas
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c) Inibição Mista Quando KI = K’I, temos a inibição não competitiva
K’I é a constante de dissociação do complexo ESI Quando KI = K’I, temos a inibição não competitiva
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Inibição Mista 1/vo [I] Sem inibidor 1/[S] - 1/Km
Inibição não competitiva a = a’ 1/vo [I] - 1/Km Sem inibidor 1/[S] (Vmax/a) [S[ Vo = Km + [S]
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Inibição Não Competitiva MISTA
Não altera a constante de Michaelis-Menten, porém diminui a velocidade máxima da reação V’max < Vmax K’m = Km Admitindo que o inverso de Km represente a afinidade enzimática, pode afirmar que este inibidor não afeta a afinidade da enzima pelo substrato Numa inibição mista Vmax diminui e Km aumenta
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Inibição Irreversível
Inibidores irreversíveis são importantes ferramentas no estudo do mecanismo de uma reação enzimática Inibição da quimotripsina com o diisopropilfluorofosfato (DIFP), leva à conclusão que a Ser195 é um resíduo chave na catálise Inibidores Suicidas: classe de inibidores irreversíveis pouco reativos, mas que no centro ativo da enzima são modificados e reagem irreversivelmente com a enzima inativando-a. São substâncias utilizadas na industria farmacêutica como remédios ou drogas de poucos efeitos colaterais
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Efeito do pH na Atividade Enzimática
Os grupos laterais dos aminoácidos podem se encontrar com carga positiva, negativa ou neutra, dependendo do pH
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Efeito da Temperatura na Atividade Enzimática
Vo Temperatura (°C) A atividade aumenta com a temperatura até o ponto onde a enzima não se desnatura
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Efeito da Concentração de Enzima na Atividade Enzimática
Vo (mmol/s) [S] em excesso Concentração de Enzima (mM) Se o substrato não estiver em excesso, a velocidade da reação atinge um valor máximo e permanece constante
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As Enzimas Reguladoras
Enzimas que têm sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais 1º Tipo: Enzimas Alostéricas: são reguladas por ligações não covalentes
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A Aspartato Transcarbamilase
R (2 cadeias)
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Inibição por Retroalimentação ou Feedback da Conversão de L-Treonina em L-Isoleucina
E1 é a enzima desidratase da L-treonina, que é inibida de forma alostérica por L-isoleucina
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Cinética Sigmoidal das Enzimas Alostéricas
Com um modulador positivo e um ne-gativo, sem alterar Vmax O substrato é um modulador positivo Com um modulador negativo que não altera K0,5
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Algumas Enzimas Reguladoras Sofrem Modificações Covalentes
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Regulação Covalente da Fosforilase do Glicogênio
Regulação alostérica por AMP (secundária)
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AMP glicose Ser-P Piridoxal-P Piridoxal-P glicose Ser-P AMP
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Regulação enzimática por clivagem proteolítica
Ativação do zimogênio por clivagem proteolítica
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Estrutura da quimiotripsina
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