Alessandra Rocha Guilherme Rezende Bruna Antônia Heitor Emílio

Apresentação em tema: "Alessandra Rocha Guilherme Rezende Bruna Antônia Heitor Emílio"— Transcrição da apresentação:

1 Biologia molecular na inspeção e certificação de produtos de origem animal
Alessandra Rocha Guilherme Rezende Bruna Antônia Heitor Emílio Cíntia Libéria Jennifer Fernandes Clara Guedes Karina Roque Fernanda Paulino Karine Christine

2 Biologia molecular Investiga as interações entre os diversos sistemas celulares, especialmente entre DNA, RNA e proteínas.

3 Biologia molecular Possibilita a caracterização de diversos genes em nível de sequência e regulação com relativa segurança; Em microbiologia de alimentos os métodos moleculares vêm substituindo os fenotípicos, como forma de confirmar a proximidade entre cepas envolvidas em um surto.

4 Biologia molecular Identificação de agentes patogênicos mais rápida, em relação aos testes microbiológicos; Fornece resultados seguros; Possibilita a tipificação de espécies.

5 Biologia molecular Importante subsídio ao monitoramento microbiano em sistemas de APPCC  PCR Pesquisas indicam as técnicas da biologia molecular como importante recurso no controle de qualidade em estabelecimentos frigoríficos.

6 Biologia molecular É um campo ainda em desenvolvimento em nível de pesquisa; Técnicas vem se aperfeiçoado cada vez mais; Desafio  tornar a técnica viável à rotina laboratorial.

7 Imagem: http://dgp.cnpq.br/buscaoperacional

8 Imagem: www.cpa.vet.ufg.br/web

9 Métodos de análise Reação em Cadeia da Polimerase (PCR);
PCR em tempo real; Western Blot; Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição (RFLP); Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE).

10 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Sequências de DNA ou RNA específicos enzimaticamente ampliadas; Altamente sensível; Alto investimento em equipamentos e reagentes; Sem padronização e regulamentação oficial quanto às técnicas.

11 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Utiliza-se uma enzima termoestável que em presença dos primers e dos nucleotídeos que compõem uma molécula de DNA amplificam a região de interesse. Ciclos repetidos em termocicladoras; Separação e visualização do material genético em géis de agarose ou poliacrilamida.

12 PCR em Tempo Real É uma técnica variante do PCR convencional que permite quantificar a expressão gênica; Associa o PCR a um sistema de detecção e quantificação da fluorescência produzida durante os ciclos.

13 PCR em Tempo Real Vantagens: Facilidade de quantificação;
Maior sensibilidade, reprodutibilidade e precisão; Rapidez; Melhor controle da qualidade no processo; Menor risco de contaminação.

14 Western Blot Método semi-quantitativo altamente específico;
Indicado para análise de poteínas insolúveis: Extração das proteínas; Separação eletroforética em gel em condições desnaturantes; Eletrotransferência das proteínas; Reações imunoquímicas de detecção de enzimas.

15 Western Blot Detecção de encefalopatia enspongiforme bovina;
Proteína protease-resistente do príon PrPSc.

16 Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição (RFLP)
Técnica se baseia no corte do DNA por enzimas de restrição que produzem fragmentos de comprimentos diferentes; Os fragmentos são separados em gel de agarose por eletroforese e transferidos para uma membrana de nylon ou poliacrilamida onde é realizada a hibridização com sonda marcada com fluorocromo ou material radioativo.

17 Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição (RFLP)
As enzimas de restrição reconhecem seqüências específicas do DNA e clivam a fita em fragmentos mais curtos.

18 Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição (RFLP)
Utilização: Genotipagem; Estudos epidemiológicos; Identificação microorganismos ; Diagnóstico laboratorial.

19 Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição (RFLP)
Principais limitações para o emprego da técnica: Técnica laboriosa não é passível de automatização; Requer alta quantidade e qualidade de DNA; Uso de várias enzimas gerando padrões altamente complexos e de difícil interpretação.

20 Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE)
Muito utilizado para análises epidemiológicas de bactérias patogênicas; É uma derivação do método convencional da eletroforese: Mudança repetida da orientação do campo elétrico; Fragmentos maiores de DNA.

21 Investigação de Escherichia coli O157:H7 no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil
Objetivo: Investigar E.coli O157:H7 em amostras de carne moída coletadas no comércio do Rio Grande do Sul. Materiais e métodos: Isolou-se a bactéria por meio de enriquecimento seletivo e depois caracterizou-se o genótipo e o fenótipo através do PCR Multiplex. As Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) ocorrem após a ingestão de alimentos contaminados por agentes biológicos, físicos e químicos. Apesar dos esforços para o controle dessas doenças, o número de casos DTA vem aumentando em diferentes partes do mundo (EVES, DERVISI, 2005), inclusive no Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010). Atualmente, as Escherichia coli compõe um dos mais importantes grupos de patógenos alimentares do mundo. Os bovinos têm sido identificados como o principal reservatório desse microrganismo, podendo excretá-lo pelas fezes, que podem contaminar culturas hortifrutigranjerios e produtos de origem animal

22 Aplicação da técnica de PCR na detecção de Yersinia enterocolitica em suínos abatidos sem inspeção
Objetivo: Avaliar a contaminação de carcaças e tonsilas de suínos por Y. enterocolitica e comparar a análise microbiológica com a técnica de PCR Resultados: Pela microbiologia não se detectou Y. enterocolitica e através de PCR detectou-se a bactéria em 40% das carcaças e em 43% das tonsilas Avaliou-se a contaminação de carcaças e tonsilas de suínos por Y. enterocolitica em estabelecimentos de abate não inspecionados, comparando a pesquisa microbiológica convencional com a técnica da reação em cadeia de polimerase (PCR), como subsídio ao monitoramento microbiano em sistemas de análise de perigos e pontos críticos de controle.

23 Aplicação da técnica de PCR na detecção de Yersinia enterocolitica em suínos abatidos sem inspeção
Conclusão: A PCR apresentou-se como técnica mais eficaz, econômica e rápida; PCR é um importante recurso para o controle de qualidade da carne suína. Não se detectou Y. enterocolitica pela técnica microbiológica convencional, mas, pela técnica de PCR foi possível detectar a bactéria em 40% das carcaças e em 43% das tonsilas, incluindo cepas patogênicas nas tonsilas. A PCR apresentou-se como uma alternativa na detecção do agente e uma técnica aparentemente mais eficaz, econômica e rápida: A pesquisa microbiológica convencional de Y.enterocolitica demanda um período de até 20 dias para a confirmação da espécie, e, para a identificação da cepa, são necessárias provas adicionais de biotipagem e sorotipagem, absorvendo mais tempo, enquanto que a técnica da PCR pode ser realizada em 24 horas. Quanto ao custo do material de consumo (meios de cultura e reagentes), a PCR foi mais econômica. Para cada amostra analisada pela PCR, gasta-se em torno de U$1,50, e pela análise convencional, U$ 9,21. Os resultados indicam a PCR como um importante recurso para o controle de qualidade da carne suína. Diante de um surto de infecção alimentar, a pesquisa convencional torna-se demorada e menos oportuna, não devendo, entretanto, ser descartada como prova complementar.

24 Coliformes fecais, estafilococos coagulase positiva (ECP), Salmonella spp. e Campylobacter spp. em linguiça frescal Objetivo: Verificar a qualidade microbiológica de linguiças frescais de carne de frango, mista e de carne suína, fabricadas artesanalmente e sob inspeção, no município de Jaboticabal – SP, Brasil. Lingüiça frescal faz parte dos alimentos expostos à contaminações e constitue um excelente meio para desenvolvimento e multiplicação de microrganismos. As bactérias do gênero Salmonella ocorrem geralmente nos animais, especialmente nas aves e nos suínos, estando presente também nos seres humanos, alimentos e meio ambiente, podendo ser patogênica para humanos e muitas espécies de animais Os coliformes fecais indicam contaminação de origem fecal recente do produto papel especialmente importante das aves dentro da cadeia epidemiológica como reservatórios As bactérias Campylobacter jejuni e Campylobacter coli ocorrem freqüentemente no trato intestinal de aves domésticas e suínos. Durante o abate estes microrganismos podem ser transferidos dos intestinos para a superfície da carne e dessa maneira pode atingir o consumidor.

25 Coliformes fecais, estafilococos coagulase positiva (ECP), Salmonella spp. e Campylobacter spp. em linguiça frescal Resultados: As amostras positivas de E. coli analisadas pelos testes de PCR Multiplex não revelaram presença de E. coli O:157, O:111 e O:113 Conclusão: A ausência destes microrganismos em lingüiça frescal pode ser explicada pelo pH, quantidade de sal e nitritos e erro nos meios utilizados para contagem. Determinou-se o número mais provável de coliformes fecais por grama (NMP/g) do produto As prováveis fontes de contaminação para esses produtos compreendem as carnes, os envoltórios, os temperos ou condimentos, bem como a água utilizada em todas as operações de limpeza e manutenção, manipulação, máquinas e utensílios. pesquisa de genes de virulência para E. coli células de E. coli O157:H7 em salsichas e que poderiam explicar a ausência destes microrganismos em lingüiça frescal, tais como: tamanho do envoltório, pH, quantidade de sal e nitritos e meios utilizados para contagem.

26 Detecção de adulterações em produtos alimentares contendo leite e/ou proteínas lácteas
Características da produção de leite de cabra e ovelhas: Flutuações sazionais quanto a presença no mercado; Preço mais elevado comparativamente ao leite de vaca; Alterações quanto aos teores de alguns constituintes. Concentacões mais elevadas de ácido capróico (C6), caprílico (C8), cáprico (C10) e láurico (C12).

27 Detecção de adulterações em produtos alimentares contendo leite e/ou proteínas lácteas
Principal adulteração: adição do leite de vaca e proteínas lácteas ao leite de cabra e/ou ovelha para prerparação de queijo; O consumo de produtos que contenham leite e este não seja declarado na rotulagem, poderá causar reações alérgicas, em indivíduos sensíveis a esse produto. Cabra, Ovelha ou Vaca?

28 Detecção de adulterações em produtos alimentares contendo leite e/ou proteínas lácteas
Métodos eletroforéticos. Métodos cromatrográficos Métodos imunológicos Métodos moleculares Espectometria em massa

29 Detecção de adulterações em produtos alimentares contendo leite e/ou proteínas lácteas
Métodos cromatrográficos: Cromatografia é uma técnica de separação de misturas e identificação de seus componentes; A eluição da a s1-caseína bovina ocorre mais tarde que a das a s1 caseínas caprina e ovina. Métodos eletroforéticos: Baseado na mobilidade das proteínas sobre a ação de uma carga elétrica; Permitem a diferenciação das proteínas do leite de vaca do leite de ovelha e cabra, a partir da y-caseinas bovinas.

30 Detecção de adulterações em produtos alimentares contendo leite e/ou proteínas lácteas
Métodos imunológicos: Relativa simplicidade dos ensaios enzimáticos e a elevada sensibilidade, devido à especificidade das reações antígeno-anticorpo; Detecção qualitativa e quantitativa de componentes alimentares e contaminantes. Métodos moleculares: Técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) baseia-se na análise de DNA, permitindo detectar e amplificar pequenos fragmentos de DNA. Espectometria em massa Determina a massa molecular das proteínas do leite e identificar variantes genéticas.

31 Detecção de adulterações em produtos alimentares contendo leite e/ou proteínas lácteas
Mais recentemente, com a técnica de PCR têm-se obtido resultados promissores. O mesmo está acontecendo com a espectrometria de massa. Máquina de PCR

32 Identificação molecular de peixes: o caso do Surubim (Pseudoplatystoma spp.)
O artigo trata da necessidade/importância do desenvolvimento de meios de identificação das diferentes espécies de peixes, no caso o surubim (Pseudoplatystoma corruscans), bem como da utilização de tecnologias biomoleculares para identificação de fraudes na comercialização de híbridos de surubim como sendo este espécime puro; A tecnologia utilizada para tal identificação foi a de Barcode Genético, que consiste na pesquisa de uma pequena sequência de DNA mitocondrial (gene COI).

33 Identificação molecular de peixes: o caso do Surubim (Pseudoplatystoma spp.)
Experimento realizado na Escola de Veterinária da UFMG onde foram analisados dois grupos de indivíduos: Hibrido de surubim, o cachapinta e o outro surubim puro (P. corruscans) Hibrido: confirmou-se sua hibridez já que foi identificado o mtDNA de cachara (Pseudoplatystoma reticulatum). Puro: identificou-se também o mtDNA de cachara, indicando assim que estes indivíduos não eram puros, ou seja, mas sim híbridos Conclui-se que a utilização dos métodos biomoleculares são de grande ajuda na identificação de híbridos de surubim, na identificação de modos de cruzamentos interespecíficos e na identificação de possíveis fraudes como a venda de híbridos do surubim como sendo surubim puro

34 Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp
Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp., Salmonella sp. e Listeria monocytogenes Os métodos moleculares são importantes para reduzir a frequência da transmissão destes patógenos aos consumidores. As técnicas moleculares, em especial a PCR, tem melhorado a identificação dessas bactérias, reduzindo o tempo de cultivo e ampliando a confiabilidade das provas diagnósticas.

35 Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp
Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp., Salmonella sp. e Listeria monocytogenes Salmonella sp. Caracterização bioquímica; Sorotipagens; Suscetibilidade a antimicrobianos; Sorologia; PCR. Alta confiabilidade Longo tempo para identificação Menor tempo de identificação Traça perfil genético

36 Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp
Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp., Salmonella sp. e Listeria monocytogenes Campylobacter sp. Isolamento do agente método mais utilizado PCR elimina o tempo de incubação, isolamento e testes bioquímicos método mais rápido

37 Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp
Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp., Salmonella sp. e Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes: Microbiologia tradicional diversos caldos seletivos de enriquecimento e ágares disponíveis para recuperação e multiplicação; PCR eficiente na identificação do patógeno. As técnicas de biologia molecular têm sido cada vez mais aplicadas na caracterização de L. monocytogenes.

38 Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp
Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp., Salmonella sp. e Listeria monocytogenes Os microrganismos estudados são de grande importância quando nos referimos aos transtornos alimentares. Dessa forma fez-se necessário o uso de técnicas que apresentem um diagnóstico preciso e eficiente a fim de se evitar surtos de infecções, que envolvem grandes danos a saúde publica.

39 Conclusão As indústria são responsáveis por assegurar a autenticidade dos produtos de origem animal, para tanto necessitam ter à sua disposição métodos que possam dar respostas precisas em tempo real. A biologia molecular vem para facilitar estas análises, assim como dar diagnósticos precisos e de forma eficiente; Os métodos moleculares vêm aos poucos substituindo as análises tradicionais, no entanto ainda serão necessárias pesquisas a fim de tornar esta tecnologia viável à rotina laboratorial.

40 Referências Bibliográficas
FERRARI, C. K. B.; TORRES,E. A. F. S. Perspectivas da Pesquisa em Biologia Molecular Aplicada à Nutrição. INCI, v.27, n.11, Caracas, 2002. TEODORO, V.a.m. et al. Aplicação da técnica de PCR na detecção de Yersinia enterocolitica em suínos abatidos sem inspeção. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec, Ufv, v. 58, n. 1, p.9-14, 2006.  SILVEIRA, Josete Baialard et al. Investigação de Escherichia coli O157:H7 no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Food Control, Porto Alegre, n. , p.1-46, 2010. CORTEZ, Ana Lígia Lordello et al. COLIFORMES FECAIS, ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVA (ECP), Salmonella SPP. E Campylobacter SPP. EM LINGÜIÇA FRESCAL. Alim. Nutr, Araraquara, v. 15, n. 3, p , 2004. VELOSO, A.C.A; TEIXEIRA, N.; FERREIRA, I.M.P.L.V.O.; FERREIRA, M.A. Detecção de adulterações em produtos alimentares contendo leite e/ou proteínas lácteas. Química Nova, Vol. 25, n.4, , 2002. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.77, n.4, p , out./dez., 2010 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA OS PATÓGENOS ALIMENTARES: CAMPYLOBACTER SP., SALMONELLA SP. E LISTERIA MONOCYTOGENES R.B. de Andrade, T. Gemelli, L.P. Dall Onder, K. Cristina, T. de Brito, A.A.L. Barboza, B.G. de Brito Instituto de Pesquisa Veterinária “Desidério Finamor”,