Sistema ABH.

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1 Sistema ABH

2 SISTEMAS ABH  Estes sistemas devem ser estudados em conjunto, pois seus antígenos são partes terminais de moléculas complexas São sistemas que portam antígenos de histocompatibilidade, pois estão presentes nos glicolipidios e glicoproteinas da membrana das hemácias e de diversos tecidos. A ocorrência e distribuição das especificidades ABH é controlada por um sistema de genes correlacionados: ABO, Hh e Sese.

3 SISTEMAS ABH / LEWIS Os genes ABO, Hh, Sese e Le produzem glicosiltransferases específicas, que atuam transferindo açúcares específicos para substâncias precursoras . Gene A  3 -  - D – N acetilgalactosaminiltransferase Gene B  3 -  - D – galactosiltransferase Gene H  2 -  - L - fucosiltransferase (ativa sobre cadeias tipo 2) Gene Se  2 -  - L - fucosiltransferase (ativa sobre cadeias tipo 1 e 2) Genes O, h e se são considerados amorfos.

4 GENES ABH E A EXPRESSÃO NAS HEMÁCIAS
Antígenos A e H Genes AA,ou AO Substância H Antígenos B e H Genes HH ,ou Hh Genes BB ,ou BO Genes AB Substância precursora Antígenos A B e H Genes OO Antígenos H Gene hh Genes AA, AO, BB, BO, AB, OO Substância precursora Nenhum antígeno GENES ABH E A EXPRESSÃO NAS HEMÁCIAS

5 SISTEMA HhSese (ISBT - 018)
GENÉTICA  O locus H (=FUT1) está localizado no braço longo do cromossomo 19q13.3 e codifica apenas a produção do antígeno H. Ele está presente em 99.9% da população. O alelo amorfo h quando presente em ambos os cromossomos, determina ausência de atividade H nas hemácias e secreções produzindo o raro fenótipo Bombay. O locus Se (= FUT2) está localizado no cromossomo 19q13.3 e está intimamente ligado ao locus H.

6 SISTEMA HhSese (ISBT0 - 018)
ANTÍGENOS A especificidade H é encontrada nas hemácias e se deve ao gene H que produz a enzima 2--L–fucosiltransferase Uma fucose é adicionada à terminação do carbono 2 da galactose formando o antígeno H que é o único antígeno deste Sistema. A substancia H é precursora dos antígenos A e B segundo determinação genética do Sistema ABO. A presença das especificidades ABH e Lewis em secreções e fluidos tissulares é regulada por um outro par dos alelos independentes: Se e se.

7 SISTEMA HhSese (ISBT - 018)
O gene Se produz a enzima 2 -  - L - fucosiltransferase que atua adicionando fucose nas substancias precursoras dos tipos 1 e 2 em diferentes células (glândulas salivares). Os indivíduos que apresentam um único alelo Se são denominados “Secretores’ e apresentam os Antígenos H, A e B em secreções e fluidos biológicos. Eles representam 80% da população. FUCOSE

8 ANTICORPOS Anti-H Anti-H quase sempre é uma aglutinina fria (IgM) natural encontrada no soro de indivíduos do grupo A1 e A1B. Não está relacionado a reação transfusional nem doença hemolítica peri-natal. Nos raros casos dos indivíduos Bombay (Oh) o anti-H produzido é um potente anticorpo que reage a 370C e determina grave reação transfusional e doença hemolítica peri-natal severa.

9 SISTEMA ABO (ISBT ) HISTÓRICO Foi descoberto por Landsteiner em 1900 GENÉTICA O genes ABO se localizam no braço longo do cromossoma 9 (posição 9q34.1-q34.2 ) Foram definidos os genes; A1 , A2 , B , O . Estes genes codificam a produção de 2 enzimas. São as glicosiltransferases  (1,3) N acetilgalactosaminil transferase (A) (1,3) galactosil transferase (B)

10 Mutações – alelos comuns ABO
Substituições no cDNA A1 – 01 A1 – 02 A1 – 03 A1 – 04 alelo de referência para os demais 467C>T 467C>T, 564C>T 297A>G A2 – 01 A2 – 02 A2 – 03 A2 – 04 467C>T, 1060delC 1054C>T 1054C>G 297A>G, 526C>G, 657C>T, 703G>A, 771C>T B1 – 01 B1 – 02 B1 – 03 B1 – 04 B1 – 05 B1 – 06 297A>G, 526C>G, 657C>T, 703G>A, 796C>A, 803G>C, 930G>A 297A>G, 526C>G, 657C>T, 703G>A, 796C>A, 803G>C 297A>G, 526C>G, 703G>A, 796C>A, 803G>C, 930G>A 297A>G, 526C>G, 657C>T, 703G>A, 796C>A, 803G>C, 871G>A, 930G>A 297A>G, 526C>G, 641T>G, 657C>T, 703G>A, 796C>A, 803G>C, 930G>A 297A>G, 526C>G, 657C>T, 669G>T, 703G>A, 796C>A, 803G>C, 930G>A O – 01 O – 02 O – 03 O – 04 O – 05 O – 06 O – 07 O – 08 261delG 106G>T, 188G>T, 189C>T, 220C>T, 261delG, 297A>G, 646T>A, 681G>A, 771C>T, 829G>A 297A>G, 526C>G, 802G>A 261delG, 579T>C 261delG, 297A>G 261delG, 646T>A, 681G>A, 771C>T, 829G>A 261delG, 297A>G, 646T>A, 681G>A, 721C>T, 771C>T, 829G>A 467C>T, 800insG

11 ANTÍGENOS Os antígenos do Sistema ABO não são restritos à membrana eritrocitária,podem também ser encontrados na saliva e líquidos biológicos, exceto fluido espinhal, de indivíduos que apresentam o gene secretor. São encontrados também na maioria das células epiteliais e endoteliais. A presença nos linfócitos e plaquetas parece ser devido à absorção do plasma Foram descritos 4 antígenos: A (001) ; B (002) ; AB (003) ; A1 (004)

12 FENÓTIPOS COMUNS GENÓTIPOS A1 A1 O , A1 A1 , A1 A2 A2 A2 O , A2 A2 O OO B BB , BO A1 B A2 B

13 Mutações – Alelos Raros ABO
Substituições no cDNA A3 – 01 Ax – 01 Ax – 02 Ax – 03 Ael – 01 Ael – 02 cisAB – 01 871G>A 646T>A 297A>G, 646T>A, 681G>A, 771C>T, 829G>A 646T>A, 681G>A, 771C>T, 829G>A 800insG 467C>T, 646T>A, 681G>A 467C>T, 803G>C B3 – 01 B(A) – 01 BX – 01 Bel – 01 Bel – 02 297A>G, 526C>G, 657C>T, 703G>A, 796C>A, 803G>C, 930G>A, 1054C>T 297A>G, 526C>G, 796C>A, 803G>C, 930G>A 526C>G, 657C>T, 703G>A, 796C>A, 803G>C, 871G>A, 930G>A 526C>G, 641T>G, 657C>T, 703G>A, 796C>A, 803G>C 526C>G, 657C>T, 669G>T, 703G>A, 796C>A, 803G>C

14 Aglutinação das hemácias com anti-soros
ABO Grupos e subgrupos Aglutinação das hemácias com anti-soros N.º Sítios antigênicos Freqüência % Presença de anti-a1 no soro Presença de anti-B ANTI-A ANTI-A1 ANTI-H A1 SIM Não 80 NÃO Sempre A2 Sim 20 1% A3 DP 30.000 0.6 POSSÍVEL AX SIM-FRACA 4.000 0.2 FREQUENTE AEND 0.1 AM 0.7 AY ? AEL SEMPRE (ANTI-A2) B3 DP   Sim   Anti-A + Anti-A1 BX Anti-B fraco BM BEL Anti-A + anti-A1 LEGENDA: DP - Dupla população

15 N-acetil galactosamina
Representação esquemática dos sítios antigênicos A2 na membrana eritrocitária N-acetil galactosamina Antígeno A2 Ceramida Glicose Galactose N-acetil glucosamina Fucose N-acetil galactosamina

16 N-acetil galactosamina
A B A1B Ceramida Glicose Galactose N-acetil glucosamina Fucose N-acetil galactosamina

17 RELAÇÃO DOS FENÓTIPOS ABO E O NÚMERO DE SÍTIOS ANTIGÊNICOS
A, B ,O NA MEMBRANA ERITROCITÁRIA Grupo sangüíneo Número de sítios do antígeno A Número de sítios do antígeno B Número de sítios do antígeno O O - 1,590,000-1,740,000 A2 160, ,000 1,080,000-1,210,000 B 610, ,000 540, ,000 A2B 120, ,000 450, ,000 300, ,000 A1 910,000-1,300,000 70, ,000 A1B 420, ,000 310, ,000 20,000-70,000

18 ANTICORPOS Anti-A Ocorre naturalmente no soro de todos os indivíduos do Grupo B. Anti-B Ocorre naturalmente no soro de todos os indivíduos do Grupo A. Anti-A,B Ocorre naturalmente no soro de todos os indivíduos do Grupo O. São potentes IgM ou IgG e determinam forte aglutinação direta com hemácias A e B respectivamente. São capazes de ativar a cascata de complemento até C9 . Determinam reação transfusional grave e doença hemolítica peri-natal de forma clínica moderada.

19 Os anticorpos do Sistema ABO são detectáveis após os 4 meses de idade
Os anticorpos do Sistema ABO são detectáveis após os 4 meses de idade. Uma das teorias proposta para seu aparecimento consiste na hétero-imunização (anatoxinas diftéricas ou tetânicas, soroterapia antitetânica, medicamentos de origem animal, vacina antigripal, infecção por Toxocara canis etc.). A gravidez e transfusão incompatível podem determinar a alo-imunização eritrocitária e o aparecimento das imunoglobulinas G.

20 Anti-A1 Este anticorpo quase sempre é uma aglutinina fria IgM encontrada em 1% dos indivíduos A2 e em 25% dos indivíduos A2B. Geralmente não está associado à reação hemolítica transfusional ou Doença hemolítica peri-natal. Na presença de anti-A1 só se faz necessário selecionar hemácias A2 para transfusão se o anticorpo reagir a 37o Celsius.

21 PATOLOGIAS E SISTEMA ABO
Os antígenos e anticorpos deste sistema estão relacionados a determinadas patologias Em pacientes com câncer de colon pode aparecer uma especificidade “B” em indivíduos do grupo. Isto porque que a N-acetilgalactosamina do antígeno A1 é transformada em galactosamina devido a um processo de desacetilização . Esta nova especificidade é denominada antígeno B adquirido Observamos uma diminuição da expressão de antígenos A ou B nos casos de Leucemias agudas devido a deficiência de produção das glicosiltransferases. Associações com doenças Grupo sangüíneo A e câncer de estômago Grupo O (não secretor) e úlcera duodenal Grupo O na febre reumática e artrite reumatóide e na doença de von Willebrand

22 DETERMINAÇÃO DO GRUPO ABO
Prova direta ou globular (Beth Vincent) Consiste em por em contato soros-teste conhecidos, anti-A, anti-B e anti-AB, com glóbulos vermelhos (GV) a serem testados, para se identificar a presença ou não dos antígenos A e B. ANTI-A ANTI-B ANTI-AB A B AB Prova reversa, sérica (Simonin) Consiste em colocar em contacto o soro a testar com pelo menos GV conhecidos A1 e B, permitindo reconhecer a presença ou não de anticorpos dirigidos contra estes antígenos. Hemácias A1, A2 e B A2 B A1 A utilização de hemácias A2 não é obrigatória, porém auxilia nos casos de discrepância ABO

23 DETERMINAÇÃO DO GRUPO ABO
Tipagem em tubo Prova direta 1.  Rotular três tubos de ensaio: A, B, AB; 2. Nos tubos adequadamente rotulados, colocar uma gota dos soros anti-A, anti-B e anti-AB, respectivamente; 3.  A cada tubo acrescentar 1gota de suspensão de GV a testar, sendo essa suspensão a 5% em soro fisiológico. 4.  Agitar os tubos e centrifugar adequadamente, em um mínimo necessário para fazer a calota de hemácias (1000 rpm durante um minuto ou rpm durante 15 segundos). 5.  Fazer a leitura da aglutinação, contra um fundo iluminado, ressuspendendo gentilmente o botão de GB. A A B B AB  AB      A B AB

24 INTERPRETAÇÃO DA TIPAGEM ABO DIRETA
Grupo O Ausência de aglutinação com os 3 anti-soros Anti-A, anti-B e anti-AB Grupo A Aglutinação com anti-A e anti-AB e Ausência de aglutinação com anti-B A B A AB B AB Grupo B Aglutinação com anti-B e anti-AB e Ausência de aglutinação com anti-A Grupo AB Aglutinação com os 3 anti-soros Anti-A, anti-B e anti-AB

25 a       Tipagem em tubo Prova reversa
1.  Rotular dois tubos de ensaio com a e b; 2.  Colocar duas gotas do soro a testar em cada tubo; 3.  Adicionar ao tubo a, uma gota de hemácias A1 a 5% e ao tubo b, uma gota de hemácias B a 5%; 4.  Agitar os tubos e centrifugar adequadamente, 5.  Fazer a leitura da aglutinação, contra um fundo iluminado, ressuspendendo gentilmente o botão de GB. A2 B A1 a b a   b    

26 INTERPRETAÇÃO DA TIPAGEM ABO REVERSA
Grupo AB Ausência de aglutinação com as 3 hemácias Grupo B Aglutinação com as hemácias A1e A2 e Ausência de aglutinação com hemácia B A1 B A1 A2 B A2 Grupo A Aglutinação com hemácias B e Ausência de aglutinação hemácias A1 e A2 Grupo O Aglutinação com as 3 hemácias A1, A2 e B

27 Validação dos testes = Concordância dos resultados
B AB A1 + B = Grupo O A2 PROVA DIRETA Ausência de aglutinação com os 3 anti-soros anti-A, anti-B e anti-AB PROVA REVERSA Aglutinação com as 3 hemácias A1, A2 e B A B + A1 AB B = Grupo AB A2 PROVA DIRETA Aglutinação com os 3 anti-soros anti-A, anti-B e anti-AB PROVA REVERSA Ausência de aglutinação com as 3 hemácias A1, A2 e B

28 Validação dos testes = Concordância dos resultados
B AB A1 + B = Grupo A A2 PROVA DIRETA Aglutinação com anti-A e anti-AB e Ausência de aglutinação com anti-B PROVA REVERSA Aglutinação com as hemácias B Ausência de aglutinação com A1 e A2 A B + A1 AB B = Grupo B A2 PROVA DIRETA Aglutinação com anti-B e anti-AB e Ausência de aglutinação com anti-A PROVA REVERSA Ausência de aglutinação com as 3 hemácias A1, A2 e B

29 CAUSAS E DISCREPÂNCIAS ABO
Grupos A fraco com presença de anti-A1 Nos indivíduos A2, A2B o antígeno A é enfraquecido de maneira considerável sem que seja patológico, assim, no momento da determinação do grupo sangüíneo, sua presença pode passar desapercebida. Como em seu soro encontra-se o anticorpo anti-A1 podemos concluir erroneamente que o indivíduo é do grupo O ou B. Este caso é uma das justificativas para a utilização das hemácias A2 na prova sérica. Soro Anti-A Anti-B Anti-AB Hemácias A1 A2 B Resultado ++ - ++++ A2B

30 Grupos A fraco e B fraco onde os antígenos correspondentes só podem ser demonstrados por técnica de fixação e eluição, pela pesquisa de substâncias ABH na saliva, por estudo genético ou por pesquisa de transferases séricas. As aglutininas frias: existe auto-aglutinação nas provas globulares e séricas devido a presença de auto-anticorpos ativos na temperatura do ensaio. Neste caso o autocontrole é positivo.

31 CAUSAS E DISCREPÂNCIAS ABO
 Poliaglutinabilidade: A poliaglutinabilidade de hemácias é um fenômeno imunológico onde um antígeno é exposto ou existe anormalmente na superfície da hemácia e é reconhecido por um anticorpo: anti-T, anti-Tn, etc. Os anticorpos monoclonais não reconhecem a poliaglutinabilidade. Presença de geléia de Wharton em sangue de cordão substância macromolecular que envolve os eritrócitos podem determinar um aspecto de pseudoaglutinados, provocando assim falsas reações positivas. Para eliminar esta substância mucóide é indispensável lavar as hemácias de cordão antes de efetuar qualquer reação. Aqui vale a pena lembrar que na determinação do grupo ABO em recém-nascidos só podemos realizar a classificação direta porque os anticorpos naturais neste momento ainda não são detectáveis.

32 Rouleaux: todas as reações são positivas na hora da determinação ABO, inclusive os testemunhos.
Observamos nas macroglobulinemias, nos mielomas, nas hiperfibrinemias. Para solucionarmos o problema, as hemácias a testar deverão ser lavadas possibilitando a prova globular. Quanto ao soro, este dever ser diluído em salina fisiológica na tentativa de diminuição protéica e permitindo a prova sérica, no entanto, esta conduta dilui também hemaglutininas anti-A e anti-B dificultando a leitura dos resultados.

33 CONCLUSÕES A determinação do grupo ABO pode nos levar a descobrir diversas doenças que determinam dificuldades de classificação: 1.  Imagem de dupla população observado em síndromes mieloproliferativas leucemias agudas, anemias refratárias. 2.  Ausência de anticorpos detectáveis pela prova sérica nos casos de leucemia linfóide crônica, nos déficits imunitários. 3.  Auto-aglutinação maciça nos casos de anemias hemolíticas por aglutininas frias. 4.  Fenômeno de Rouleaux nas hiperproteinemias. 5.  Poliaglutinabilidade - especificidade Tn em estados pré-leucêmicos.

34 CLASSIFICAÇÃO SANGUÍNEA ABO
DISCORDÂNCIA ENTRE AS PROVAS DIRETA E REVERSA CONCORDÂNCIA ENTRE AS PROVAS DIRETA E REVERSA VALIDADE DO TESTE AUTO- AGLUTININA S FRIAS POLIAGLUTI- NABILIDADE AC CONTRA ANTÍGENO PÚBLICO SUB- GRUPOS PRÉ-AQUECIMENTO DE REAGENTES E AMOSTRAS TRATAMENTO DAS HEMÁCIAS COM REAGENTES ESPECIAIS REAGENTES MONOCLONAIS TESTEMUNHO S (ALO, AB E AUTO) REAGENTES ANTI-A1 ANTI-H