UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA Métodos Fenotípicos para.

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA Métodos Fenotípicos para Caracterização dos Mecanismos de Resistência aos Antimicrobianos Prof. Robson Leão

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4 Natural ou intrínseca Adquirida Plasmidial
Aeróbios Anaeróbios aminoglicosídeos Adquirida Cromossômica Mutação de genes Resistência é transmitida da célula-mãe para célula-filha Plasmidial Transmissível Resistência múltipla Produção: ß-lactamases, fosfotransferases, hidrolases, redutases. Metronidazol Quinolonas

5 Para que eu preciso saber disso????

6 Benefícios e vantagens na profilaxia?!
Riscos e Desvantagens do Uso Indiscriminado e Profilático dos Antimicrobianos: 1- Cada espécie de bactéria apresenta características próprias; 2- Fenômeno de resistência bacteriana; 3- Modificações produzidas na microbiota normal; 4- Efeitos colaterais de natureza tóxica, irritativa ou alérgica; 5- Drogas dispendiosas. Benefícios e vantagens na profilaxia?!

7 Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Variável entre os países, regiões e origem hospitalar ou comunitária das estirpes; Algumas espécies apresentam resistência/sensibilidade difundida em todo mundo; A pressão seletiva do uso de antimicrobianos exerce papel fundamental na magnitude e disseminação da resistência.

8 SENTRY – Sistema de Vigilância para Monitoramento dos Principais Patógenos Relacionados a Infecções Hospitalares SENTRY SP, RJ RS, SC

9 Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI – antigo NCCLS)
Organização internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento e a ampla utilização de normas e procedimentos laboratoriais padronizados. A subcomissão do NCCLS é composta de representantes de profissões, do governo e indústria, incluindo laboratórios de microbiologia, educadores, farmacêuticos, etc.

10 Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI – antigo NCCLS)
Recomendações na escolha dos antimicrobianos Padronização das técnicas Critérios para a interpretação dos resultados Parâmetros para o controle qualidade do teste.

11 MRSA GISA GRSA VRE ESBL P. aeruginosa MR Acinetobacter MR Metalo-lactamase O que fazer diante das “super-bactérias”??

12 Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Fenótipos de resistência relevantes na prática médica: 1- MRSA/ORSA=Staphylococcus aureus resistente à metilicina e oxacilina Primeiro caso foi descrito em hospitais da Europa nos anos 60, e nos anos 70 já se tornava um problema de saúde pública Acima de 50% dos isolados de S. aureus em UTI Mutação cromossômica: produção de novas PBP, mediada pelo gene mec A.

13 Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
2- MRS = Staphylococcus coagulase negativa (SCN) resistente à metilicina e oxacilina Durante muito tempo, considerados como destituídos de patogenicidade, usualmente relatados como contaminantes. Hoje, importante papel nas infecções hospitalares e as taxas tem sido correlacionadas com o uso crescente de procedimentos médicos invasivos e o aumento no número de imunocomprometidos. 75% dos SCN isolados de UTI’s são resistentes a meticilina.

14 Taxas de resistência aos antimicrobianos em 100 cepas de SCN, determinadas pelo método de difusão em ágar – HUPE UERJ, Antimicrobianos

15 Caracterização da Resistência à Meticilina
Testes Convencionais: Teste de difusão em ágar e diluição em ágar, caldo (CMI) e Teste E.

16 Testes Comerciais: Vitek, ATB, MicroScan, dentre outros:
Caracterização da Resistência à Meticilina Testes Comerciais: Vitek, ATB, MicroScan, dentre outros:

17 Caracterização da Resistência à Meticilina
Testes Moleculares: Detecção do gene mecA

18 Caracterização da Resistência à Meticilina
Testes Imunoenzimáticos  Teste do látex PBP 2a Outros:

19 S. aureus S. aureus R à meticilina  Vancomicina R vancomicina
1996 – foi isolada amostra com susceptibilidade reduzida no Japão 1997 – 2 casos de infecções por VISA nos EUA 2002 – isolamento de VRSA nos EUA VISA – MIC = 8-16 g/mL VISA – MIC > 32 g/mL

20 MRSA Mecanismo de Resistência
Produção de uma proteína específica – PBP 2a ou PBP 2’ codificada pelo gene mec A Afinidade reduzida a ß-lactâmicos mecA → Cassete Cromossômico Estaficlocócico (SCCmec) → elemento genético móvel → SCCmec I, II, III, IV e V

21 CA-MRSA MRSA HA-MRSA

22 CA-MRSA Manifestações clínicas
Infecções leves: abscessos e celulites Infecções graves: pneumonias necrozantes, osteomielites e septicemias podendo levar a óbitos.

23 Epidemiologia 1º caso CA-MRSA – Aborígenes australianos na década de 90 Emergência mundial Surtos em populações especificas

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25 CA-MRSA Primeiros casos – década de 90
Apresentam características distintas da cepas HA-MRSA: → SCCmec IV e V → Suscetibilidade a várias classes de antimicrobianos, resistência somente aos ß-lactâmicos → PVL Ausência de fatores de risco específicos – indivíduos saudáveis

26 Cepas obtidas de Porto Alegre a partir de infecções de pele e tecidos moles
4 cepas → PFGE – clone OSWP (Oceania) USA300

27 CA-MRSA no Brasil

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29 Fatores de Risco Ao contrário do HA-MRSA, surtos de CA-MRSA tem sido reportados entre indivíduos saudáveis e sem fatores de risco associados. Definição de infecção por CA-MRSA – CDC: → Ausência de história previa de isolamento de MRSA → Ausência de hospitalização e/ou cirurgia durante os 12 meses anteriores ai isolamento do MRSA → Ausência de relato de catereres percutâneos, próteses, ou de outros artigos e procedimentos invasivos no momento da coleta ou nos últimos 12 meses que a antecederam

30 SCCmec Origem das cepas de CA-MRSA:
Elemento genético móvel Carreia complexos de genes mec e ccr 5 tipos: I,II,III → HA-MRSA IV e V → CA-MRSA Tipo IV: menor tamanho. Perda de genes de resistência? Origem das cepas de CA-MRSA: 1ª hipótese → deleções de genes de resistência de HA-MRSA 2ª hipótese → transferência de SCCmec para MSSA

31 Leucocidina de Panton-Valentine (PVL)
É uma exotoxina, composta de 2 subunidades que são codificadas pelos genes lukS-PV e lukF-PV (genes pvl) → lise em PMNs Isolados de CA-MRSA responsáveis por doenças carreiam PVL com prevalência praticamente universal → Associada aos casos de infecções mais graves Exemplo: pneumonias associadas a S. aureus pvl-positiva está mais frequentemente associada com sepse, febre alta, leucopenia e hemoptíase, derrame pleural e morte.

32 CA-MRSA in Cystic Fibrosis
Chest / 133 / 6 / June, 2008.

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34 Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Fenótipos de resistência relevantes na prática médica 3- VRSA/GISA (VISA) = Staphylococcus sp resistente/sensibilidade intermediária à glicopeptídeos A partir de 1996 no Japão (VISA) Posteriormente: EUA, França, Alemanha, outros Brasil: resistência intermediária em RJ, SP e Porto Alegre Mutação cromossômica: hiperprodução de PBP, espessamento da parede celular e aprisionamento das drogas por excesso dos componentes da parede

35 Caracterização da Resistência Intermediária a glicopeptídeos (GISA ou ViSA):
Teste de difusão em ágar com halos de inibição inferiores a 14 mm para vancomicina; Confirmar resultados determinando a CMI (8-16 mcg/mL)  intermediário.

36 Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Fenótipos de resistência relevantes na prática médica 4- Enterococcus spp. resistente à vancomicina (VRE) A partir de 1986 no Reino Unido Posteriormente: EUA, Europa, Japão, América Central e do Sul Brasil: 1996-Curitiba; 1997-SP; 2000–RJ; 2001–Porto Alegre Resistência plasmidial e cromossômica: produção de precursores alterados do peptideoglicano, que não são reconhecidos pela vancomicina

37 Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
VRE no Rio de Janeiro Rio de Janeiro: HUPE/UERJ - Enterococcus gallinarum Hospital da rede pública - E. faecalis Hospital da rede privada - E. faecium Niterói: HU Antônio Pedro/UFF - Enterococcus faecalis

38 Caracterização da Resistência a glicopeptídeos (VRE):
Inicialmente teste de difusão em ágar; Diluição em ágar ou caldo Resistência à Vancomicina Resistência Elevada: CMI ≥ 64 mcg/mL Baixo nível: CMI 8 – 32 mcg/mL Teste moleculares: Van A, Van B, Van D, E, G, R, X e outros.

39 Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Fenótipos de resistência relevantes na prática médica 5- Enterococcus sp HLAR (High-Level Aminoglycoside Resistance) Elevado nível de resistência à aminoglicosídeos Mutação no alvo ribossômico (Estreptomicina) Inativação enzimática (Estreptomicina e Gentamicina)

40 Caracterização a Níveis Elevados de Antimicrobianos - HLAR:
Teste de difusão em ágar – disco difusão: (concentração elevadas de aminoglicosídeos). HLAR conc. do disco R I S Gentamicina μg >10 Estreptomicina μg >10 CLSI-2006

41 Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Fenótipos de resistência relevantes na prática médica 6- Enterobactérias produtoras de ESBL (-Lactamase de Espectro Estendido) Resistência transferível: hidrólise de cefalosporinas de amplo espectro (ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima), degradam todos os monobactâmicos e beta-lactâmicos com exceção dos carbapenens e cefamicinas. Geralmente, inibidas pelos inibidores de -Lactamase (ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam) Vários genes: TEM, SHV, PER, GES, CTX, OXA...

42 Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Fenótipos de resistência relevantes na prática médica Enterobactérias produtoras de ESBL (-Lactamase de Espectro Estendido) Primeira ESBL: Klebsiella ozaenae (Alemanha) Posteriormente: Klebsiella pneumoniae (França) Hoje: > 200 tipos de ESBL caracterizados K. oxytoca, E. coli, Enterobacter spp, Proteus mirabilis, P.aeruginosa, Acinetobacter spp.

43 Caracterização Beta – Lactamase de Espectro Ampliado
Todos os métodos fenotípicos se baseiam na inibição da atividade da enzima pelos inibidores de -lactamases (IBL) Limites de triagem do CLSI (antigo NCCLS) Teste de Adição de IBL aos discos de cefalosp. Discos combinados Teste de dupla-difusão em disco Etest Métodos automatizados

44 Caracterização Beta – Lactamase de Espectro Ampliado
Disco difusão: Utilizar discos de ceftazidima e cefotaxima sozinhos e os associados ao ácido clavulânico Meio de Müller-Hinton  POSITIVO Aumento do halo  5 mm da associação CAZ/AC ou CTX/AC vs. halo de CAZ ou CTX Detecção de amostras produtoras de ESBL Teste confirmatório recomendado pelo CLSI E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis

45 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Jacoby & Han, 1996 Carter et al., J Clin Microbiol. 38:4228, 2000. Detecção de amostras produtoras de ESBL Teste de adição de IBL

46 Detecção de amostras produtoras de ESBL
2 3 1.Cefpodoxima, 2. Cefpodoxina + Ác. Clavulânico, 3. Ceftazidima, 4. Ceftazidima + Ác. Clavulânico, 5. Cefotaxima 6. Cefotaxima + Ác. Clavulânico 1 4 6 5 Detecção de amostras produtoras de ESBL Discos combinados

47 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Disco-difusão dupla ou teste de aproximação Teste Positivo Vantagens Teste simples; Não necessita de reagentes especiais Limitações Distância entre os discos; Armazenamento dos discos com ácido clavulânico; Interpretação

48 Detecção de amostras produtoras de ESBL
Etest® Vantagens Teste simples; Limitações Substrato específico; Não detecção de amostras, cuja as MICs situem acima das diluições testadas; Custo

49 Detecção de amostras produtoras de ESBL Métodos Automatizados
MicroScan – Painéis de Gram-negativos Triagem para ESßL Poços que contêm cefpodoxima 4 g/mL e ceftazidima 1 g/mL associados ao clavulanato ESßL plus Confirmation Panel Antimicrobiano (conecntação testada em g/ml) Aztreonam 0.5 – 64 Cefpodoxima 0.5 – 64 Cefepima 1 – 32 Ceftazidima 0.5 – 128 Cefoxitina 2 – 32 Ceftazidima/Clav4 0.12/4 – 16/4 Cefotaxima 0.5 – 128 Ceftriaxona 1 – 64 Cefotaxima/Clav4 0.12/4 – 16/4 Meropenem 0.5 – 16 Cefotetan 1 – 32 Piperacillina 16 – 64 Imipenem 0.5 – 16 Detecção de amostras produtoras de ESBL Métodos Automatizados

50 Detecção de amostras produtoras de ESBL Métodos Automatizados
Vitek – Painéis de Gram-negativos Triagem para ESßL Poços que contêm cefotaxima e ceftazidima 0,5 g/mL associados ao clavulanato Detecção de amostras produtoras de ESBL Métodos Automatizados

51 Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:
Fenótipos de resistência relevantes na prática médica 7- P. aeruginosa produtora de Metalo -  lactamase: Resistência transferível: hidrólise de penicilina, cefalosporinas e carbapenemas (imipenem, meropenem, ertapenem) Primeiramente caracterizada do anos 90 em Enterobactérias, P. aeruginosa e Acinetobacter spp. (Japão) Brasil (SENTRY): 44,8% de resistência à imipenem em P. aeruginosa  43,9% por metalo -lactamase

52 Resistência aos carbapenens
Metalo--lactamases Genes cromossômicos e plasmidiais (tranposons, integrons) Zn++ como cofatores enzimáticos Inibidas por EDTA e compostos derivados do thiol Família IMP-1 a -16 (Japão, China, Europa, Canadá, Portugal, Taiwan, Brasil) Família VIM-1 a -11 (Argentina, Colômbia, Europa, Coréia, Taiwan, EUA) GIM-1 (Alemanha) SPM-1 (São Paulo Metalo- -lactamase) outras ...

53 Detecção de Metalo- -lactamases Importância Clínica
A maior parte da produção destas enzimas é mediada por genes plasmidiais, que podem se disseminar entre espécies distintas  Medidas de Controle

54 Detecção de amostras produtoras de MBL Disco- aproximação IMBL
Distância de mm CAZ IMBL Distância de 4-5 cm EDTA – 5 l 100 mM 2-MPCA puro – 2 a 3 l Ceftazidima

55 Detecção de amostras produtoras de Metalo--lactamases
NEGATIVA POSITIVA Disco- aproximação com ácido 2-mercaptopropiônico

56 Detecção de amostras produtoras de Metalo- -lactamases - Etest
Critério de positividade : Redução  3.0 diluições

57 Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa Producer of SPM Metallo--Lactamase in Distinct Brazilian Regions

58 KPC Notar a distorção do halo de inibição, que é indicativa da produção de carbapenemase pela amostra de K. pneumoniae testada, pelo método de disco-difusão.

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60 Medidas de Combate à Resistência:
Reversão do estado de sensibilidade primitiva por perda de fatores de resistência ou por mutação; Uso de altas concentrações do antimicrobiano pra superar o mecanismo de inativação; Rodízio do uso de antimicrobianos em hospitais; Uso da associação de antibióticos; Descobertas de novas drogas antimicrobianas; Inibição do mecanismo bioquímico da resistênica; Vigilância epidemiológica e Sistemas de controle de Infecção Hospitalar; Restrição do uso de antimicrobianos; Educação para prescrição e o uso racional de antimicrobianos

61 Bactérias Multiresistentes ?!?!

62 Obrigado!!