Diagnóstico de Infecção por Eritrovírus B19 em pacientes com AIDS: Imunoistoquímica, hibridização in situ e exame histopatológico da medula óssea Sérgio.

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1 Diagnóstico de Infecção por Eritrovírus B19 em pacientes com AIDS: Imunoistoquímica, hibridização in situ e exame histopatológico da medula óssea Sérgio Setúbal Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação em Patologia Experimental do Departamento de Patologia da UFF, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Abril de 2005

2 Orientadoras: Solange Artimos de Oliveira, Professora Titular da Disciplina de Doenças Infecciosas e Parasitárias do Departamento de Medicina Clínica, Faculdade de Medicina, UFF e Jussara Pereira do Nascimento, Pesquisadora Titular, Biomanguinhos, Fiocruz

3 Aos professores da Banca Examinadora Às minhas orientadoras
Agradecimentos Aos professores da Banca Examinadora Às minhas orientadoras À Profª Andréia Rodrigues Cordovil Pires À Profª Eliene Carvalho da Fonseca Aos professores da Disciplina de DIP Ao Curso de PG em Patologia Experimental À técnica Valéria Ferreira da Silva

4 1ª parte: Introdução

5 Parvoviridae Densovirinae (insetos) Densovirus Iteravirus Brevidensovirus Parvovirinae (vertebrados) Parvovirus (autônomos) Dependovirus (adeno-associados) Erythrovirus (precursores eritróides)

6 Yvonne Cossart, 1974 painel B, soro 19

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9 Cossart, 1974 30% dos doadores tinham anticorpos Paver e Clarke, 1976 triagem de rotina em doadores dois doadores partículas morfológica e imunologicamente semelhantes ao B19 França, 1972, antígeno “Aurillac” Japão, 1979, vírus “Nakatani”

10 1981: Crise aplástica transitória
Estudo sobre a influência das infecções virais nas doenças congênitas, Departamento de Virologia da Escola de Medicina do King’s College em Londres, em 1981 800 soros de crianças testados para diversos vírus dois soros com linhas de precipitação ao CIE para o eritrovírus B19 duas crianças falcêmicas, em crise aplástica transitória os soros de outras 12 crianças com CAT foi então examinado: 6 continham o vírus, 5 tinham IgM e 1 apresentou soroconversão

11 Owren, 1948 crise aplástica transitória
presença de pró-normoblastos gigantes no aspirado de medula óssea

12 Owren, 1948 crise aplástica transitória
presença de pró-normoblastos gigantes no aspirado de medula óssea

13 Owren, 1948 crise aplástica transitória
presença de pró-normoblastos gigantes no aspirado de medula óssea

14 Owren, 1948 crise aplástica transitória
presença de pró-normoblastos gigantes no aspirado de medula óssea

15 crise aplástica transitória: Serjeant, Jamaica, desde 1952
a maior parte em crianças aglomeração de casos no espaço e no tempo epidemias que se repetiam a cada 3 ou 5 anos nunca há um segundo episódio no mesmo indivíduo

16 Anderson, et al. 1983, epidemia de eritema infeccioso no norte de Londres, em março de 1983
33 soros estudados para IgM contra o B19, por MAC-RIA: todos positivos Anderson et al., 1985 Estudo experimental em voluntários

17 1984: hidropisia fetal não imune 1986: anemia persistente em indivíduos imunodeprimidos

18 Manifestações clínicas
eritema infeccioso e formas assintomáticas em indivíduos normais viremia, com febre, calafrios, mialgias desaparição transitória dos reticulócitos discreta queda na hemoglobina tudo é interrompido pelo aparecimento de anticorpos eficazes surgem sintomas de doença por imunocomplexo: exantema e artralgias

19 O exantema é caracteristicamente descrito como “em face esbofeteada”...

20 ... ou como tendo o aspecto “rendilhado”.

21 Manifestações clínicas
crise aplástica transitória em indivíduos com anemia hemolítica grande viremia, com sintomas mal caracterizados, desaparição transitória dos reticulócitos enorme queda na hemoglobina, anemia aguda necessitando transfusão, paciente virêmico tudo é interrompido pelo aparecimento de anticorpos eficazes, mas não há sintomas de deposição de imunocomplexos

22 Manifestações clínicas
aplasia eritrocítica pura em pacientes imunocomprometidos viremia prolongada queda na hemoglobina, anemia crônica, necessitando transfusões repetidas, paciente virêmico não há produção de anticorpos, ou estes são ineficazes tudo pode ser interrompido pela administração de gamaglobulina padrão

23 Manifestações clínicas
hidropisia fetal não imune anemia intra-uterina incompatível com a expansão do éritron anemia somada à miocardite determinam insuficiência cardíaca e anasarca pequeno ou nenhum potencial teratogênico prognóstico em geral bom pode haver anemia crônica no recém-nato

24 Outras manifestações clínicas
artralgias isoladas miocardite meningite asséptica hepatite síndrome hemofagocítica síndrome de luvas e meias síndrome febril inespecífica 20 a 30% das infecções são assintomáticas

25 Diagnóstico Laboratorial
O eritrovírus B19 não é facilmente cultivável A escolha dos testes depende do quadro clínico e das disponibilidades laboratoriais Detecção de anticorpos anti-B19 (IgM e IgG) no soro (de pacientes imunocompetentes).

26 Diagnóstico Laboratorial
hemaglutinação, hemaglutinação em gel Detecção de DNA no soro ou tecidos (hibridização, dot-blot, PCR) de pacientes imunocomprometidos ou com CAT PCR (falsos positivos, ausência de significado clínico); real-time PCR?

27 Diagnóstico Laboratorial
no aspirado de medula óssea, pronormoblastos gigantes nas tecidos fixados pelo formol, “células em lanterna” Células grandes, dotadas de um corpúsculo de inclusão intranuclear eosinofílico, algo vítreo, que desloca a cromatina para a periferia

28 2ª parte: Justificativa

29 Vigilância Epidemiológica das Doenças Exantemáticas
desde janeiro 1994 Vigilância Epidemiológica das Doenças Exantemáticas Disciplina de Doenças Infecciosas e Parasitárias, Departamento de Medicina Clínica, Faculdade de Medicina, UFF Disciplina de Virologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto Biomédico, UFF Departamento de Virologia, Fundação Oswaldo Cruz

30 Em 1996... identificação de IgM específica em 24 pacientes com infecção pelo eritrovírus B19

31 Em Outros trabalhos se seguiram, sobre as características clínicas das doenças exantemáticas, incluindo as provocadas pela infecção pelo eritrovírus B19.

32 Em 2000... a não muito comum ocorrência de uma CAT em paciente adulto.

33 Em Dados clínicos e amostras de sangue colhidos de 55 pacientes com AIDS ou HIV positivos, entre setembro de 1997 a janeiro de 1998, para um estudo piloto. 50 dos 55 tinham IgG nenhum tinha IgM seis pacientes tinham dot-blot positivo, mas não houve confirmação por PCR Conclusões: alta prevalência de IgG e ausência de infecção

34 Em 2001... Revisão para J bras Doenças Sex Transm 13(4):55,2001

35 105 desses pacientes tinham IgM contra o eritrovírus B19
Em O número de pacientes atendidos desde 1994 já era de 673. 330 pacientes (49%) eram negativos quanto a presença de IgM para dengue, rubéola, sarampo, ou para a presença de IgG de baixa avidez para o herpes-vírus humano tipo 6. 105 desses pacientes tinham IgM contra o eritrovírus B19 A variação sazonal tornou-se mais clara. Dois surtos, um em 1994 e outro em 1998/1999 faziam prever o retorno do B19 em 2004/2005

36 Primeiros vislumbres da sazonalidade: Casos de doença exantemática e parvovirose conforme o mês ( )

37 Distribuição dos casos de doença exantemática entre janeiro de 1994 e dezembro de 2004
2002 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2003 2004

38 Em 2003. O trabalho do “dualismo”
Em O trabalho do “dualismo”. Diferenças entre as manifestações clínicas da infecção conforme o grau de imunidade em dois pacientes HIV-positivos, um deles com AIDS.

39 Em Revisão para capítulo de livro: Setúbal, S.; Oliveira, S. A. Eritrovírus B19. In: Tavares, W. & Marinho, L. A. C. Rotinas de Diagnóstico e Tratamento das Doenças Infecciosas e Parasitárias 1ª edição. São Paulo, Atheneu, 2005.

40 3ª Parte: Trabalhos ligados ao projeto apresentado ao Curso de PG em Patologia Experimental em julho de 2002

41 Objetivos 1. Detectar doadores virêmicos no Banco de Sangue do Hospital Universitário Antônio Pedro. 2. Detectar, em material de medula óssea estocado em parafina evidências de infecção por eritrovírus B19 em pacientes com AIDS ou HIV positivos.

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43 Em teste de um método simples para detecção de doadores, com o encontro de um doador virêmico no HUAP. HUAP, 1998, 496 amostras HUAP, 1999, 522 amostras INCa, 1999, 529 amostras 1303 amostras testadas 7 com resultados equívocos 1 fracamente positiva

44 1 fortemente positiva Uma comerciária de 26 anos, doou a 19 de outubro de 1999 freqüência de doadores virêmicos 1:831 o teste de hemaglutinação em gel poderia ser útil para a detecção de grandes viremias em períodos de alta atividade do vírus na comundidade

45 Objetivos Detectar, no material de medula óssea estocado em parafina, por meio de imunoistoquímica, hibridização in situ e exame histopatológico, evidências de infecção por eritrovírus B19 em pacientes com AIDS ou HIV positivos submetidos a necropsia ou biópsia de medula óssea no Hospital Universitário Antônio Pedro, durante os anos de 1988 a 2002.

46 Antecedentes Desde 1985, surgiram na literatura internacional diversos trabalhos sobre AIDS e B19 Notava-se entre esses trabalhos a quase que total ausência de estudos brasileiros Os dois trabalhos existentes tinham sido publicados pelo nosso grupo Ocorreu-nos a idéia de verificar se era possível detectar a presença de B19 no material de necropsia dos pacientes falecidos por AIDS no HUAP O âmbito do trabalho foi depois estendido às biópsias

47 Material e Métodos No livro de registro de necropsias do SAP foi feita a seleção de todas aquelas em que havia alguma menção à AIDS ou ao HIV, entre 1º de janeiro de 1988 e 31 de dezembro de 1998. O mesmo foi feito em relação às bíópsias de medula óssea. Nove biópsias realizadas em seis pacientes entre 1999 e 2002 foram acrescentadas ao estudo, por terem sido consideradas suspeitas de infecção por B19.

48 Material e Métodos O exame histopatológico das lâminas coradas em HE foi realizado com a ajuda a Profª Andréia Rodrigues Cordovil Pires no Serviço de Anatomia Patológica do HUAP

49 Material e Métodos A imunoistoquímica foi realizada no Laboratório de Imunoistoquímica e Hibridização do Serviço de Anatomia Patológica do HUAP

50 Material e Métodos desparafinação bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio a 3% recuperação antigênica em solução e citrato aquecida bloqueio das ligações inespecíficas com leite desnatado

51 Material e Métodos anticorpo primário de policlonal, de coelho, diluído a 1/50 anticorpo secundário suíno biotinilado polivalente conjugado estreptavidina-peroxidase cromógeno e substrato: 3,3’-diaminobenzidina ou DAB

52 Material e Métodos A hibridização in situ foi conduzida no laboratório da Disciplina de Virologia do Departamento de Microbiologia e Parasitologia, no Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense

53 Material e Métodos desparafinação digestão com proteinase K mistura de hibridização plasmídios marcados com dUTP biotinilado plasmídios marcados com dUTP ligado a digoxigenina

54 Material e Métodos selagem das lamínulas e estufa ou forno de micro-ondas em câmara úmida complexo estreptavidina fosfatase alcalina antidigoxigenina/fosfatase alcalina

55 Resultados de 1º de janeiro de 1988 a 31 de dezembro de 1998 foram realizadas 297 necropsias de pacientes com AIDS

56 Resultados Eram parte das 4336 necropsias realizadas no Hospital Universitário Antônio Pedro entre janeiro de 1985 e dezembro 2003.

57 Necropsias feitas no HUAP entre 1985 e 2003
Resultados Necropsias feitas no HUAP entre 1985 e 2003

58 Resultados Das 297 necropsias de pacientes com AIDS, em apenas 110 havia reservas estocadas em parafina. Dentre essas 110, apenas 42 continham os blocos correspondentes ao material de medula óssea. Como havia por vezes mais de um bloco por necropsia, o total de blocos de medula óssea obtidos das necropsias foi de 49.

59 Resultados De janeiro de 1988 a dezembro de 1998 foram realizadas no HUAP 1324 biópsias de medula óssea em 984 pacientes. Destas biópsias, 30 foram feitas em 25 pacientes com AIDS. Como muitas biópsias tinham mais de um bloco estocado, o número de blocos correspondentes a elas foi de 39. A estes 39 blocos foram acrescentados outros nove, recuperados de seis outros pacientes submetidos a biópsia de medula óssea entre 1999 e 2002.

60 Resultados O material consistiu na sua totalidade de 48 cortes provenientes de biópsias de medula óssea (31 pacientes) e de 49 cortes provenientes de necropsias (42 pacientes). As distensões sangüíneas das biópsias, coradas ao Wright/Giemsa, não foram recuperadas. Todos estes 97 cortes, correspondentes a 73 pacientes (60 homens e 13 mulheres), foram estudados inicialmente por exame histopatológico convencional (HE) e por imunoistoquímica.

61 Resultados à HE 85 cortes (63 pacientes) foram considerados adequados para leitura à HE. 12 dos 97 cortes (10 pacientes) foram (por falha de coloração, ausência de material), considerados impróprios para leitura. A escassez de material (o esgotamento dos blocos de parafina) impediu a confecção de novas lâminas.

62 Resultados à HE Dos 85 cortes lidos, evidenciou-se a presença de inclusões sugestivas de infecção pelo eritrovírus B19 em 20 (23,5%). Esses 20 cortes pertenciam, cada um deles, a um paciente diferente. Dos 73 pacientes estudados em nosso trabalho, 63 tinham material adequado para o exame à HE e 20 apresentaram resultado positivo.

63 Resultados à HE

64 Resultados à HE

65 Fígado fetal, controle positivo

66 Rim fetal, controle positivo

67 Resultados à HE Figura 4. Medula óssea corada ao HE. Inclusões eosinofílicas intranucleares sugestivas de infecção pelo eritrovírus B19 (setas). Lâmina N x.

68 N HE 40 x

69 N HE 40 x

70 Resultados à Imunoistoquímica
87 cortes, pertencentes a 65 pacientes, foram submetidos a imunoistoquímica, sendo 10 deles (8 pacientes) considerados positivos Esses dez cortes já tinham sido lidos à HE, tendo se verificado a presença de inclusões em sete; em um dos cortes (N96-240) o número de inclusões tinha sido considerado grande.

71 Resultados à Imunoistoquímica

72 Resultados à Imunoistoquímica
Figura 5. Células de Spodoptera frugiperda infectadas por baculovírus recombinante expressando a proteína VP2 do eritrovírus B19 (positivas à imunocitoquímica, em castanho) e células normais (coradas pela hematoxilina, em azul), para efeito de comparação.

73 Resultados à Imunoistoquímica
Figura 6. Imunoistoquímica em placenta (949) sabidamente positiva à hibridização para eritrovírus B19. As células positivas estão marcadas em castanho. 20 x.

74 Resultados à Imunoistoquímica
Figura 11. Imunoistoquímica em medula óssea. Lâmina número B Célula positiva, marcada em castanho. 40 x.

75 Resultados à Imunoistoquímica
Figura 12. Imunoistoquímica em medula óssea. Lâmina número N Células positivas, marcadas em castanho. 20 x.

76 Resultados à Imunoistoquímica

77 Resultados à Imunoistoquímica
Figura 14. Imunoistoquímica em medula óssea. Reexame. Lâmina número B , 20 x. Célula positiva marcada em castanho.

78 Resultados à Imunoistoquímica
Figura 15. Imunoistoquímica em medula óssea. Reexame. Lâmina número B , 20 x. Células positivas marcadas em castanho.

79 Resultados à Imunoistoquímica
Figura 17. Imunoistoquímica em medula óssea. Reexame. Lâmina número N96-240, 40 x. Célula positiva marcada em castanho.

80 Correlação dos Resultados

81 Resultados da Hibridização in situ

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83 7 cortes positivos em 18 examinados
2 cortes (2 pacientes) intensamente positivos, 1 corte (outro paciente) fracamente positivo, 4 cortes (4 outros pacientes) positivos Ou seja: 7 cortes positivos em 18 examinados (7 pacientes em 15)

84 Resultados à Hibridização
Figura 18. Hibridização in situ em medula óssea. Lâmina número N , 20x

85 Resultados à Hibridização
Figura 19. Hibridização in situ em medula óssea. Lâmina número N , 40x

86 Resultados nos 17 cortes submetidos às três técnicas

87 Resultados nos 14 pacientes submetidos às três técnicas

88 Discussão

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90 Conclusões Os resultados positivos à HE ocorreram em maior número que os positivos à imunoistoquímica e estes últimos em maior número do que os obtidos por hibridização (embora este último exame tenha sido realizado num número menor de pacientes). Houve alguma correlação (kappa de 0,5 corrigido para a baixa prevalência) entre os achados à HE e à imunoistoquímica.

91 Conclusões Apenas um paciente mostrou resultados inequívocos com as três técnicas. A freqüência de infecção por eritrovírus B19 (de pelo menos 1,4%) no material examinado necessita confirmação por estudos adicionais, melhor padronizados, de caráter prospectivo e com o concurso da observação clínica, muito escassa no nosso trabalho.

92 Conclusões O exame da medula óssea à HE, pela sua simplicidade, pode e deve ser empregado como um teste de triagem em pacientes HIV-positivos com anemia. O encontro de inclusões intranucleares indica o emprego de técnicas moleculares (imunoistoquímica, hibridização em dot-blot, ou PCR quantitativo) para confirmar o diagnóstico.

93 Conclusões Estes exames devem ser realizados sempre que uma causa alternativa para a anemia não puder ser determinada. A confirmação ou a exclusão do diagnóstico de infecção por eritrovírus B19 são especialmente necessárias quando há alta atividade vírus na comunidade a que pertence o paciente.

94 Perspectivas futuras Os resultados do presente estudo nos estimulam a procurar estabelecer, de forma prospectiva, e empregando métodos diferentes, a importância da infecção por eritrovírus B19 entre os pacientes HIV-positivos ou com AIDS.

95 Perspectivas futuras A magnitude desse problema talvez só possa ser determinada com estudos que contemplem também a minuciosa coleta de dados clínicos, incluindo aí a resposta ao tratamento com gamaglobulina. Temos colhido sistematicamente, após a assinatura de um termo de consentimento livre e esclarecido, amostras de sangue de todos os pacientes que se apresentam para testes de carga viral e contagem de células CD4+.

96 Perspectivas futuras O objetivo é determinar a soroprevalência, a incidência de soroconversão e a existência e freqüência das viremias, bem como de manifestações clínicas possivelmente associadas a elas. Já temos, em fevereiro de 2005, cerca de 1550 soros, colhidos de 472 pacientes. É nossa intenção concentrar esforços na implementação e execução desse projeto.

97 Muito obrigado