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MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE PARASITOSES.

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1 MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE PARASITOSES

2 AMOSTRA A amostra a ser colhida para o teste imunológico dependerá do sítio de infecção do parasita e do tipo de teste utilizado. Ex.: soro, líquor, urina, fezes, tecidos etc. Na maioria dos testes, trabalha-se com diluições (seriadas ou não) das amostras títulos

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4 Formação de agregados visíveis como resultado da interação de Ac específicos e partículas insolúveis que contenham determinantes Ag em sua superfície. Pode ocorrer em: partículas que apresentem Ag naturais de superfície (hemácias, bactérias, protozoários) – aglutinação direta partículas inertes (látex) ou com células antigenicamente não relacionadas, às quais se adsorvem ou se fixam Ag solúveis – aglutinação indireta Hemaglutinação Aglutinação do látex REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO

5 TESTE DE HEMAGLUTINAÇÃO Testa Ac IgG e IgM Hemácias de carneiro ou humanas do grupo O, fixadas com formaldeído ou glutaraldeído, sensibilizadas com o Ag (polissacarídicos ou protéicos) Suspensão das hemácias em solução estabilizadora para evitar reações inespecíficas Adição do soro em diluições progressivas

6 Teste positivo: formação de tapete Teste negativo: formação de botão

7 TESTE DE AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX Usado na detecção de Ag ou Ac polissacarídeos Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser usadas como suportes na adsorção de proteína solúvel a Ag polissacarídeos

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9 A ligação Ag-Ac promove a fixação do complemento, cujo consumo (in vitro) pode ser empregado para detecção de Ac, Ag ou ambos. O teste é realizado em duas etapas: fixação do complemento: Ag incubado com Ac na presença de uma quantidade definida de complemento. Se Ag e Ac correspondentes estiverem presentes, há ativação da cascata do complemento e haverá consumo do complemento adição do revelador da reação: hemácias de carneiro sensibilizadas com hemolisina (Ac anti-hemácia de carneiro obtido em coelhos) A medida da atividade hemolítica do complemento no sistema indicador permite detectar a presença de Ag ou Ac na mistura inicial e sua quantidade. REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

10 1. fixação do complemento2. revelação da reação

11 Baseia-se na capacidade das moléculas de Ac se ligarem a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o Ag. Fluorocromos: substâncias que, quando excitadas com luz UV, absorvem luz de um comprimento de onda menor e, instantaneamente, emitem luz de comprimento de onda maior (fluorescência). : usado geralmente para detectar a presença do Ag em uma amostra clínica. Teste de Imunofluorescência Direto: usado geralmente para detectar a presença do Ag em uma amostra clínica. usado para detectar a presença, no soro, de Ac específicos. Teste Imunofluorescência Indireto: usado para detectar a presença, no soro, de Ac específicos. TESTE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

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13 Imunofluorescência Indireta (IFI)

14 IFI positivo para T. cruzi IFI para T. gondii: (A) positivo e (B) negativo A B

15 IF positivo para G. duodenalis Ag

16 reação Ag-Ac monitorada por medida da atividade enzimática (peroxidase). leitura visual ou fotométrica, com substratos coloridos, fluorescentes ou luminescentes. originando um produto solúvel e colorido. para a peroxidase o substrato é o H 2 O 2 e os cromógenos: ortofenilenodiamina, ácido 5-amino salicílico, ortotoluidina etc, que serão oxidados originando um produto solúvel e colorido. ELISA Direto: detecta Ag ELISA Indireto: detecta Ac TESTE DE ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

17 ELISA indireto

18 ELISA direto (ELISA sandwich)

19 Interpretação dos resultados: leitura visual espectrofotômetro (absorbância)

20 PARÂMETROS SOROLÓGICOS

21 SENSIBILIDADE: porcentagem de resultados verdadeiramente positivos em indivíduos comprovadamente infectados ESPECIFICIDADE: porcentagem de resultados verdadeiramente negativos em indivíduos comprovadamente sadios EFICIÊNCIA: concordância dos resultados verdadeiros positivos e negativos em indivíduos com e sem infecção VALOR PREDITIVO POSITIVO: probabilidade do resultado positivo ser verdadeiramente positivo VALOR PREDITIVO NEGATIVO: probabilidade do resultado negativo ser verdadeiramente negativo

22 indivíduos resultado infectadosnão infectadostotal positivo verdadeiro positivo (VP) falso positivo (FP) VP + FP negativo falso negativo (FN) verdadeiro negativo (VN) FN + VN totalVP + FNFP + VNVP + FP+ FN + VN SENSIBILIDADE (S) = VP / total infectados ESPECIFICIDADE (E) = VN / total sadios EFICIÊNCIA (Ef) = VP + VN / total indivíduos VALOR PREDITIVO POSITIVO (VPP) = VP / total resultados positivos VALOR PREDITIVO NEGATIVO (VPN) = VN / total resultados negativos

23 Variação da sensibilidade e especificidade do teste de acordo com o cut-off

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27 Influência da prevalência nos valores preditivos

28 Variação dos valores preditivos dependendo da prevalência

29 exercícios


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