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TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS. UM TESTE SOROLÓGICO PODE SER QUALITATIVO, SEMI-QUANTITATIVO OU QUANTITATIVO... Qualitativo: + ou – Semi-quantitativo: amostra testada.

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1 TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS

2 UM TESTE SOROLÓGICO PODE SER QUALITATIVO, SEMI-QUANTITATIVO OU QUANTITATIVO... Qualitativo: + ou – Semi-quantitativo: amostra testada foi diluída – a maior diluição que apresentar reação é o seu título (ex. + ate a diluição 1:320) Quantitativo: informa quantidade absoluta do material detectado. IMPORTANTE : Finalidade do teste - 1.Triagem 2.Diagnóstico ?

3 Alguns fatores que afetam as medições das reações Ag/Ac Afinidade Avidez Taxas Ag-Ac Reações Cruzadas Anticorpos: Monoclonais Policlonais

4 TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS Técnicas sem uso de marcadores – Reações de Precipitação – Reações de Aglutinação Técnicas com uso de marcadores – ELISA – Citometria de fluxo – Imunofluorescência – Radioimunoensaio

5 TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS PRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese AGLUTINAÇÃO - Aglutinação direta e indireta - Inibição da aglutinação - Teste de Coombs IMUNOENSAIOS - Radioimunoensaio - ELISA - Imunofluorescência - Citometria de Fluxo PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO

6 SENSIBILIDADE DE DIFERENTES TESTES DE IMUNODIAGNÓSTICO

7 REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO ZONA DE EQUIVALÊNCIA EFEITO PRÓ - ZONA EFEITO PÓS - ZONA

8 IMUNODIFUSÃO DUPLA Possui baixa sensibilidade ; demorado (18-24 hrs) Utiliza uma matriz de ágar Ag + Ac = linha de precipitação visível

9 Ac Ag Ac Ag Ac Ag As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação Pode ser visualizada pós lavagem do gel, para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante Utilização da técnica : caracterizar antigenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenças auto-imunes Coloca-se agarose sobre uma lâmina: Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo: Ac

10 Interpretação – Diâmetro do anel é proporcional à concentração do Ag Método de Mancini – Anticorpo no gel – Antígeno no poço –Vice-versa IMUNODIFUSÃO RADIAL Ag Concentração Diameter 2 Ag Ac no gel

11 IMUNODIFUSÃO RADIAL Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas Fácil, baixo custo Utiliza uma matriz de ágar É quantitativa

12 IMUNOELETROFORESE +- Ag 1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna canaleta 2- Anti-soro na canaleta canaleta 3- Difusão e precipitação Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitação. É qualitativo Utiliza lâminas recobertas com ágar Útil para detectar gamopatias monoclonais, como mieloma múltiplo e a macroglobulinemia

13 IMUNOELETROFORESE

14 REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO Pode ser direta ou indireta + sensíveis qtidade de Ac 500 vezes menor partículas amplificam a reação Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi- quantitativo) Agregação visível de partículas Eritrócitos Bactérias Fungos látex USO: Tipagem ABO Testes confirmatórios para sífilis, FR

15 2) Reagente (anticorpo anti A, B): AGLUTINAÇÃO DIRETA 1) Amostra de sangue na placa teste: Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO) Partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais na sua superfície + Ac = Aglutinação 3) Controle negativo: 4) Mistura-se: Hemácias Bactérias Protozoários

16 AGLUTINAÇÃO DIRETA 5) Leitura do resultado: negativo positivo Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste);

17 AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA) Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa. O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa. Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço. Aglut + Aglut - Ags solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias)

18 AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX: FATOR REUMATÓIDE Fator Reumatóide: Anticorpos que reconhecem epítopos presentes na fração cristalizável (Fc) da molécula de IgG. A maioria destes Acs são da classe IgM porém pode-se encontrar também Acs IgA e IgG. Teste: Visualização de aglutinação das partículas de látex revestidas pelo antígeno (no caso IgG humana ou de coelho) Interpretação: No caso de artrite reumatóide surge uma alta quantidade de FR de alta afinidade Causas viraisHBV, HCV, Mononucleose, influenza, AIDS, pós vacinação Doenças auto- imunes Artrite Reumatóide, Lúpus Eritematoseo sistêmico, Esclerose sistêmica, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjörgren, cirrose biliar, hepatite auto-imune, etc NeoplasiasApós irradiação ou quimioterapia Infecções bacterianas Tuberculose, sífilis, hanseníase, salmonelose, endocardite bacteriana subaguda, brucelose, borreliose Doenças parasitárias Malária, esquistossomose, filariose, tripanossomíase Enfermidades em que o encontro de FR é comum

19 TESTE DE COOMBS (Antiglobulina) DIRETO : Detecta Ac ligados a eritrócitos INDIRETO: Detecta Ac anti-eritrócitos no soro 1.Permite detectar incompatibilidade Rh - DHRN (mãe produz IgGantiRh). 2.R. medicamentosa 3.R. transfusional

20 Teste baseado na inibição da aglutinação devido a competição com antígeno solúvel. INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação. Resultado negativo:(ausência de hCG na urina): ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.

21 Princípio da técnica: Anticorpos ou antígenos são conjugados a um fluorocromo, que, quando excitado por radiações UV, emite luz no espectro visível. A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um microscópio de fluorescência Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) IFA direta: Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais, e doenças imunológicas renais e de pele. IFA indireta: pesquisa de antígenos ( plasmódio em hemácia) e de anticorpos ( sífilis, toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, doença de chagas, malária, etc)

22 IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

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24

25 Treponema pallidum Pneumocystis carinii Tripanosoma cruzi Giardia lamblia

26 Separação de células marcadas por fluorescência; Anticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD) Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. É um teste qualitativo e quantitativo. Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em uma corrente através de um feixe de Laser. CITOMETRIA DE FLUXO ( célula medida em movimento ) CD 4 CD 18 CD 125 CD 147

27 CITÔMETRO DE FLUXO SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ. SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.

28 CD4 CD8 CD20

29 USO Determinar o tipo e n o de céls. sanguíneas brancas Isolar populações celulares Quantidade, tamanho, granulosidade; Distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ag s Tamanho celular.

30 APLICAÇÕES CLÍNICAS DA CITOMETRIA DE FLUXO - Análise da subpopulação linfocítica - Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas, HIV - Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo - Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas - Análise de reticulócitos - Detecção de anticorpos antiplaquetários - Quantificação de células progenitoras (Stem cells) - Avaliação imunológica de paciente transplantado

31 Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. O produto final ação da enzima sobre o substrato = COR Produto final corado leitura em fotocolorímetro. Principais tipos de ELISA: indireto, direto e competitivo. Vantagens do ELISA: -Utiliza reagentes estáveis -Teste de alta sensibilidade -Seguros e de baixo custo -Não trabalha com radioisótopos -pode ser adaptado tanto a testes simples quanto à automação -Não depende de formação de precipitado, aglutinado, etc. Direto = Ag Indireto = Ac

32 Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA substrato Qualitativos Quantitativos Ac marcados com Enzimas + + Ag Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase DIRETO OU SANDUÍCHEINDIRETO = COR

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34 Ponte de corte ( cut-off) : é o limiar de reatividade; define o limite entre um teste negativo e um teste positivo

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37 ESTE EXEMPLO É DE ELISA DIRETO OU INDIRETO?

38 CURVA PADRÃO - ELISA

39 RADIOIMUNOENSAIO - RIA Moléculas marcadas com isótopo ( I 125,I 131 ) Marcações: I 125 : emite raios gama H 3 : raios beta Desvantagem manipulação de isótopo radioativo.

40 RADIOIMUNOENSAIO

41 Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas (urina ou soro de atletas), etc. Vantagens: – Alta sensibilidade – Permite medidas rápidas e precisas – Limiar de detecção em nanogramas e picogramas. Desvantagens: – Custo – Vida média dos reagentes – Risco operacional (radiação) RADIOIMUNOENSAIO


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