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1de15 Aproximação entre Análises Químicas e Microbiológicas 30 e 31 de Outubro de 2006.

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1 1de15 Aproximação entre Análises Químicas e Microbiológicas 30 e 31 de Outubro de 2006

2 2de15 Detecção de metabolitos Um método indirecto para controlar a existência de microrganismos será detectar, por análise química, a existência de compostos vestigiários que sejam produtos de metabolismo e indicadores de actividade (micro)biológica. Por exemplo: –A detecção de toxinas (como a aflatoxina ou as biotoxinas marinhas) é, por si própria, importante pois trata-se de substâncias perigosas para a saúde. –Compostos responsáveis por odores atípicos ou desagradáveis em produtos alimentares. – Acetaldeído em xaropes de isoglucose.

3 3de15 Métodos Rápidos em Microbiologia Estes métodos permitem obter estimativas de contagens totais que podem ser úteis como parâmetro de higiene, para detecção precoce de deterioração, ajuda para previsão de prazos de validade. Relativamente aos tempos de realização pode tomar-se como valores indicativos: –2 a 10h envolvendo ainda o crescimento de microrganismos. –Tempo inferior a 1h envolvendo a contagem de microrganismos ou detecção de componentes celulares ou metabolitos.

4 4de15 Medição de Impedância (1de2) A impedância duma solução Impedância = resistência + capacitância é um parâmetro que pode ser alterado devido ao crescimento de microrganismos. A amostra, muitas vezes na forma de zaragatoa vai ser usada para inocular meio de cultura contido numa célula de medida de impedância. Este meio de cultura é favorável ao crescimento de grande variedade de microrganismos e adequado para que sejam fáceis de detectar mudanças de impedância.

5 5de15 Medição de Impedância (2de2) Este método é bastante usado em indústrias alimentares. As indústrias de lacticínios são exemplos de indústrias bastante difíceis do ponto de vista microbiológico no que diz respeito ao controlo de higiene industrial. Nos aparelhos modernos, várias amostras podem ser ensaiadas em paralelo e a diferentes temperaturas (RABIT = Rapid Automated Bacterial Impedance Technique).

6 6de15 Detecção de Compostos Característicos de Vida: ATP O ATP (trifosfato de adenosina) é um composto característico de vida pois é essencial nos processos energéticos de muitos seres vivos. Várias espécies biológicas são capazes de produzir radiação luminosa e a reacção correspondente envolve o consumo de ATP. Um exemplo típico de bio-luminiscência encontra- se nos pirilampos (Photinus pyralis) em que a emissão de luz é utilizada como forma de comunicação.

7 7de15 Reacções na Emissão de luz dos Pirilampos Mg 2+ E + LH 2 + ATP E.LH 2 -AMP + pp O 2 E.LH 2 -AMP Oxi-LH 2 +CO 2 +AMP +luz(560nm) E – Luciferase LH 2 – Luciferina pp – pirofosfato A regeneração da oxiluciferina vai ser feita por coenzima A e pirofosfato. Vale a pena destacar o rendimento quântico da reacção de emissáo de luz.

8 8de15 Luminómetro No Luminómetro, usa-se a reacção que ocorre nos pirilampos, entre o ATP com luciferina catalisada por luciferase e que origina emissão de luz.. Esta reacção permite dosear ATP por medição de luminiscência. Há aparelhos portáteis que são utilizáveis na realização de ensaios in loco e as medições são rápidas e fáceis fazer. Há que atender a que a quantidade de ATP libertada por microrganismos não é igual para todos.

9 9de15 Detecção de Compostos Característicos de Vida: Ácidos Nucleicos Os ácidos nucleicos são, por excelência, compostos característicos da existência de vida e há compostos como o alaranjado de acridina, que reagindo com os ácidos nucleicos dão produtos fluorescentes tornando os microrganismos facilmente detectáveis. A epifluorescência baseia-se na observação desses compostos fluorescentes que põem em evidência a presença de microrganismos. Relativamente à contagem, pode fazer-se ao microscópio ou com contadores.

10 10de15 Compostos Usados em Epifluorescência Ha diversos compostos que reagindo com ácidos nucleicos produzem compostos fluorescentes. São exemplos: – Iodeto de propídio. –Alaranjado de acridina: –DAPI (4´,6-diamine-2-phenylindole) pode permitir a detecção de uma molécula simples de ADN em solução. Para detecção numa célula, a quantidade de ADN é da ordem dos fentograma.

11 11de15 Ensaios Imunológicos Mediante a utilização de anticorpos podem ser detectados microrganismos ou os seus metabolitos num modo específico. Nestes ensaios, aproveita-se a alta especificidade destas reacções bioquímicas. Por outro lado, a detecção é relativamente simples sendo muitas vezes possível a detecção visual ou com simples espectrofotómetros. A simplicidade e eficiência destes ensaios faz com que também sejam usados em análise química.

12 12de15 Métodos ELISA ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) corresponde a uma designação que tem sido usada para métodos análise em que um antigene ou anticorpo é ligado a um enzima para detectar a ligação a anticorpo ou antigene. Estes ensaios são muitas vezes usados como métodos de rastreio e permitem detectar, por exemplo, proteínas, péptidos, drogas ou pesticidas presentes nas amostras em estudo mesmo que em baixas concentrações (da ordem de ppb ou ppt).

13 13de15 Kits para Análises (1de2) Seria tarefa muito complicada para um especialista em análise química proceder à preparação dos compostos necessários para estas análises em que seria necessário partir do composto que se pretende estudar e obter anticorpos em que estaria ligado um enzima. Além disso tinha que se testar para verificar se iria dar resultados dignos de confiança.

14 14de15 Kits para Análises (2de2) Acontece que para algumas análises difíceis mas em que há um grande número de interessados, estão comercializados kits que facilitam muito o trabalho de laboratório. São fornecidos em caixas que já trazem todos os reagentes necessários e embora os kits sejam muito caros quqndo se vai calcular o preço por análise, conclui-se que as análise até são relativamente baratas quando comparadas com as que se fazem mediante técnicas avançadas de análise química.

15 15de15 ELISA: Exemplos de Aplicação Há numerosos exemplos de aplicação em análises de rastreio de substâncias como drogas proibidas ou pesticidas em produtos alimentares. Podem ocorrer reacções cruzadas (falsos positivos) com substâncias semelhantes ao analito e que existam em solução. Os ensaios positivos terão que ser confirmados mediante a aplicação de técnica analítica mais específica sendo vulgar o uso de métodos cromatográficos (eventualmente com detecção por espectrometria de massa).


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