PROF: DIOGO SILVA Isolamento de DNA e RNA
INFORMAÇÕES
Isolamento de DNA e RNA Ácidos nucléicos DNA e RNA. Objetivo: Estudar as informações que as moléculas carregam. Estudo e análise das informações Isolamento Necessário
Material para isolamento Bulbo do cabelo Ossos Tecidos (em geral ) Gordura (muito pouco) Sangue ???? Hemácias x células de defesa (células brancas) Anucleadas Sem DNA Nucleadas Com DNA
Área de Pesquisa Pesquisa com DNA: Diagnósticos (Bactérias, Vírus de DNA) Medicina Forence (Paternidade, identificação criminal) Reprodução (Sexagem Fetal) Epedemiologia (Variabilidade genética de cepas) Pesquisa com RNA: Diagnóstico (vírus de RNA) Análise de Expressão génica
Métodos de Isolamento Utiliza reagentes que tem objetivo a lise da membrana celular. Exposição do DNA e RNA. Reagentes: Fenol/Clorofórmio ( método padrão- mais utilizado) Detergentes ( SDS, Xilex) Ácidos Fenólicos Kits Perigo!!!! Uso de EPI
Isolamento de DNA Processamento Manual Fenol/Clorofórmio ( método padrão- mais utilizado) Detergentes ( SDS, Xilex) Kits (binding magnético e coluna) Extração Bancada Binding Magnético Placa com reagente que liga-se ao DNA Coluna DNA retido na coluna
Isolamento de RNA Processamento Manual Ácidos Fenólicos ( TRIZOL ®, TRI-REAGENTE ®, QIAZOL ® ). Cloreto de Lítio (planta) Kits (binding magnético e coluna)
Isolamento automatizado de DNA e RNA Grande demanda Extratores de DNA e RNA
Análise do Isolado Após a etapa de extração Objetivo: Avaliação da qualidade Medir a concentração Métodos: Eletroforese em gel de agarose Espectrofotômetro ( comprimento de onda DNA = 280 e RNA= 260)
Análise do Isolado Gel de AgaroseEspectrofotômetro
Análise do Isolado PCR - Reação em Cadeia da Polimerase Sequenciamento Southern Blot Northern Blot