Engenharia Bioquímica I Universidade de São Paulo Escola de Engenharia de Lorena Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial Engenharia Bioquímica I Prof. Júlio César dos Santos

Esterilização de equipamentos Esterilização: eliminação de todas as formas de vida (O termo esterilização possui um significado absoluto e não relativo) Dependendo do processo, não é desejável ou necessária (por exemplo, esterilização por calor danifica vitaminas)

Esterilização de equipamentos Não é necessária em processos nos quais são produzidos inibidores microbianos (etanol, vinagre, ácido lático, etc.) Em laticínios não é desejável esterilizar pois pode danificar os produtos. É feita só uma redução da carga contaminante por pasteurização.

Esterilização de equipamentos Indústria de alimentos: não necessariamente é feita a esterilização. Mantém-se a população restante sob controle por refrigeração, congelamento, uso de sal / açúcar, conservantes, biocidas, bioestáticos Processo destinado a saúde humana e enlatados: esterilização rigorosa

Esterilização de equipamentos Métodos físicos e químicos Reatores: calor úmido Equipamentos para processamento de produtos de fermentação : calor úmido ou agentes químicos Material de laboratório: calor úmido / calor seco (mais raramente por radiação UV)

Esterilização de equipamentos Meios de fermentação : calor úmido (se não for possível, filtração por membranas ou cartuchos) Ar: cartuchos Os métodos de esterilização agem destruindo estruturas microbianas (paredes celulares, ácidos nucléicos) ou inativando enzimas e proteínas, ou ainda induzindo a formação de substâncias letais no interior das células. O número de micro-organismos que sobrevive a um processo depende da população inicial presente (importância da limpeza)

Esterilização de equipamentos Modo de ação Calor úmido Desnaturação irreversível das proteínas microbianas A resistência das proteínas ao calor é função da hidratação da célula (quanto mais água, maior o poder de destruição) Vapor de água entra nos domínios internos das proteínas, causando mudanças irreversíveis

Esterilização de equipamentos Modo de ação Calor úmido Carboidratos também sofrem alteração : caramelizam e geram produtos tóxicos - Vapor sob pressão (autoclaves): transferência de calor (favorecida pela condensação, levando a um rápido aumento na temperatura); nível de hidratação das células

Esterilização de equipamentos Modo de ação Calor seco Oxidação das constituintes celulares (dependendo do conteúdo de água na célula, pode ocorrer também a coagulação de proteínas) Transferência de calor mais lenta e menor nível de hidratação

Esterilização de equipamentos Modo de ação Calor seco Menos eficiente : ao contrário do calor úmido, nesse tipo de esterilização o calor é transferido muito lentamente e o nível de hidratação das células tende a diminuir, conferindo urna certa proteção às proteínas. Organismo de controle da eficiência do método (calor): Bacillus stearothermophilus

Esterilização de equipamentos Modo de ação UV Absorvida por ácidos nucléicos, onde causa lesões Região abiótica : 220-300nm (253,7nm é o λ mais eficaz) Purinas e pirimidinas: 260nm (gera ligações que causam mutações, impedem a replicação do DNA)

Esterilização de equipamentos Modo de ação UV Aminoácidos aromáticos: 280nm Nos ácidos nucléicos, as pirimidinas são mais sensíveis Ligações cruzadas entre pirimidinas adjacentes (geram dímeros)

Esterilização de equipamentos Modo de ação UV Há mecanismos de reparo do DNA, dependendo do nível da lesão Vários fatores podem influenciar na sensibilidade microbiana a UV. Destacam-se o pH e o estado fisiológico das células (a maior atividade é na fase logarítmica de crescimento), constituição genética

Esterilização de equipamentos Modo de ação Radiação ionizante Raios α, β,γ,x, prótons, elétrons, nêutrons Perda de viabilidade por dano ao DNA Sob radiação ionizante, um átomo emite elétrons de elevada energia, ionizando sua molécula. Este elétron é absorvido por outro átomo (processo em cadeia)

Esterilização de equipamentos Modo de ação Radiação ionizante Geram-se radicais químicos altamente reativos, os quais podem alterar grupamentos químicos em moléculas importantes para as células, podendo ainda “quebrar” as fitas de DNA

Esterilização de equipamentos Modo de ação Radiação ionizante Geralmente, a sensibilidade dos diferentes organismos a radiações ionizantes varia com o volume de DNA. Em geral, formas multicelulares são mais sensíveis à radiação ionizante que organismos unicelulares

Esterilização de equipamentos Modo de ação Óxido de etileno É um gás inflamável, corrosivo, explosivo e carcinogênico (bem penetrante) Éter cíclico : mata por ser agente alquilante Alquilação de proteínas, ácidos nucléicos e outras moléculas (substituição de um átomo de hidrogênio pela molécula de EtO aberta)

Esterilização de equipamentos Modo de ação Óxido de etileno

Esterilização de equipamentos Modo de ação Óxido de etileno É usado em mistura com CO2 e hidrofluorocarbonetos, o que reduz o risco de incêndios e explosão A eficácia depende de fatores como concentração, temperatura, umidade e tempo de exposição

Esterilização de equipamentos Modo de ação Óxido de etileno Tira-se todo o ar da câmara e injeta-se óxido de etileno. Exposição por 6h. Depois, retira-se todo o óxido de etileno antes de abrir a câmara novamente. Organismo de controle da eficiência do método: Bacillus atrophaeus

Esterilização de equipamentos Modo de ação Glutaraldeído Age na superfície das células Reage com aminas livres de peptideoglicano de bactérias, o que interfere no transporte de aminoácidos de baixo peso molecular Pode fazer ligações cruzadas entre as células (aglutinação celular)

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor úmido Uso mais frequente Fácil obtenção, manuseio, eficácia e com custo relativamente baixo Vapor é produzido em caldeiras e distribuído por dutos de aço galvanizado ou inox, isolados termicamente

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor úmido Pelas altas temperaturas e pressões nas caldeiras, o vapor é considerado estéril. No entanto, em alguns casos mais críticos, utiliza-se filtração em cartuchos esterilizantes imediatamente antes da entrada do vapor no processo.

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor úmido: reatores vazios Injeta-se vapor para expulsar o ar (para evitar a formação de bolsões de ar) Fecha-se o sistema e injeta-se vapor até a temperatura e pressão adequadas

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor úmido: reatores vazios Espera-se o tempo necessário Injeta-se ar esterilizado (para expulsar o vapor impedindo que gere vácuo, o que poderia causar danos ao reator ou promover a entrada de ar externo não-esterilizado através de fissuras, fendas, etc.) Carrega-se o meio

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor úmido: reatores com meio Descontínua, feita em 3 etapas Deve-se agitar o meio (1) Injeta-se vapor (96-97 °C) na serpentina ou camisa Necessária a relação adequada entre volume e a área de troca de calor

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor úmido: reatores com meio (2) Injeta-se vapor vivo até 100 °C Fecha-se o sistema até atingir a pressão e temperatura desejadas (3) A injeção direta de vapor é cortada e controla-se a pressão e temperatura pela serpentina ou camisa

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor úmido: reatores com meio O tempo depende das condições do reator/processo (Ex.: Se for um reator multipropósito, utilizado com bactérias ou fungos formadores de esporos altamente resistentes ao calor, ele deve passar por assepsia química antes da esterilização por vapor e a esterilização por vapor deve ser mais longa)

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor úmido: reatores com meio Pode ser automatizada A injeção direta de vapor provoca um aumento no volume de meio de cultura de cerca de 10 a 15%, em função da condensação. Por essa razão, o meio de cultura deve ser preparado concentrado, tendo em vista sua posterior diluição pelo condensado.

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor úmido: reatores com meio Autoclaves: reatores de pequeno porte, vidrarias, meios de cultura O aquecimento para geração de vapor pode ser elétrico ou a gás Nas autoclaves verticais a porta de acesso localiza-se na parte superior. As horizontais podem ter uma ou duas portas de acesso.

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor úmido: reatores com meio Vapor pode ser gerado internamente ou em uma caldeira e injetado na autoclave A esterilização em autoclave não altera significativamente o volume dos líquidos presentes nos frascos ou reatores.

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor seco Aplicada a vidrarias, metais e sólidos resistentes ao calor Menos eficiente que o calor úmido, por isso usa-se maior temperatura e mais tempo Utilizada para materiais que não podem entrar em contato com umidade (podem oxidar)

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Calor seco Geralmente acima de 150°C Tempos podem chegar a 3-4h UV Aplicada a materiais sólidos como vidrarias, utensílios metálicos, embalagens, etc.

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos UV Não deve ser usada na presença de pessoas ou animais Deve-se controlar a vida útil das lâmpadas (a emissão diminui com o tempo) Baixa penetração: apenas superficial (método auxiliar; demora várias horas)

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Radiação Gama Produzida por cobalto 60 ou césio 137 Alto poder de penetração Não resulta em radiação residual (método seguro)

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Radiação Gama O bombardeio de microrganismos por gama altera as moléculas de DNA, danificando-as - em geral irreversivelmente. Adicionalmente, inúmeras moléculas internas aos microrganismos são ionizadas (a água, por exemplo), dando origem a espécies tóxicas altamente reativas, como os peróxidos e vários radicais livres.

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Radiação Gama Essas moléculas desestruturam o equilíbrio bioquímico dos microrganismos, mesmo esporulados. Feita em câmaras especiais, em geral grandes Operação contínua (emissão espontânea)

Esterilização de equipamentos Esterilização por agentes físicos Radiação Gama Material circula sobre esteiras em containers Aplicada a vidrarias, metais, material sólido (pó, solo, sementes, embalagens, etc) Unidade de medida é o Gray (1 gray = 100 rad) Micro-organismo mais resistente: Deinococcus radiodurans - 60 quilograys

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Método usado em equipamentos ou componentes nos quais não se pode empregar vapor úmido devido a incompatibilidade dos materiais de construção desses componentes com temperaturas elevadas Filtros, bombas, centrífugas, válvulas, linhas de transferência de fluidos, equipamentos de medição

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Germicidas químicos Em geral líquidos Agem em temperatura ambiente Requerem maior tempo de contato

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Germicidas químicos Capacidade ligada à propriedades do material (material plástico ou metálico, superfície lisa ou rugosa, porosidade do material, ausência ou presença de locais de difícil acesso) e as características ambientais (pH, presença de matéria orgânica, formação de filmes, dureza da água, presença de sabão)

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Germicidas químicos Há muito desenvolvimento devido a problemas de infecção hospitalar

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Nível de resistência dos microorganismos: página 32-34 1. Bactéria Esporulante: alto Bacillus subutilis, Clostridium sporogenes 2. Micobactérias : alto a intermediário Mycobacterium tuberculosis var. bovis

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Nível de resistência dos micro-organismos: página 32-34 3. Vírus pequenos ou não lipídicos : alto a intermediário Poliovírus, rhinovírus 4. Fungos : intermediário a baixo Trichophyton spp., Cryptococcus spp., Candida spp.

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Nível de resistência dos micro-organismos: página 32-34 5. Bactéria vegetativa : baixo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella choleraesuis 6. Vírus médios ou lipídicos : baixo Vírus da herpes simplex, Citomegalovírus

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Germicidas de alto nível a) Germicidas de nível alto (para esporos bacterianos) Soluções aquosas de glutaraldeído, peróxido de hidrogênio 6-30% e produtos contendo ácido peroxiacético e H2O2 (0,1% e 1% v/v, respectivamente)

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Germicidas de alto nível a) Germicidas de nível alto (para esporos bacterianos) ClO2 : fortemente oxidante e corrosivo (uso limitado em superfícies de metal ou plástico) Formaldeído em solução : efetivo, porém carcinogênico

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos b) Germicidas de nível intermediário Devem inativar Mycobacterium tuberculosis var. bovis, fungos, vírus lipídicos ou não lipídicos e bactérias vegetativas (porém não necessariamente esporos bacterianos) Etanol ou Isopropanol nas porcentagens de 70-90% Compostos clorados 500-5000 ppm de cloro livre

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos b) Germicidas de nível intermediário Solução aquosa de H2O2 3-6% Preparações fenólicas

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos c) Germicidas de nível baixo São capazes de destruir formas vegetativas de bactérias, a maioria dos fungos e vírus que contém lipídeos em sua composição Compostos quaternários de amônio 0,1 a 0,2 %

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Para desinfeção / esterilização do equipamento A) desmontagem do equipamento (se for o caso) B) limpeza dos componentes (usar detergente, se for o caso) C) lavagem com água de baixa dureza (para remoção de detergentes) D) montagem do equipamento e introdução da solução germicida (pelo tempo necessário)

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Para desinfeção / esterilização do equipamento E) drenagem da solução germicida F) remoção de germicidas com água ou outro fluido estéril Tempo de exposição varia com o nível de sanitização desejado, o tipo de germicida e as características da população microbiana (tipo e número) que se pretende destruir

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Agentes gasosos Normalmente não empregados em indústria de fermentação para esterilizar equipamentos Assepsia de salas e laboratórios : vapores de formaldeído Óxido de etileno : esterilização dos mais diversos itens hospitalares, artigos plásticos de laboratório e outros materiais

Esterilização de equipamentos Esterilização e desinfecção por agentes químicos Agentes gasosos Óxido de propileno : esterilização de alimentos Formaldeído ou betapropiolactona : desinfeção de câmaras, solos e ambientes Resistência dos microrganismos depende do agente usado, da concentração deste, da umidade relativa e da temperatura do processo