TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
UM TESTE SOROLÓGICO PODE SER QUALITATIVO, SEMI-QUANTITATIVO OU QUANTITATIVO ... Qualitativo: + ou – Semi-quantitativo: amostra testada foi diluída – a maior diluição que apresentar reação é o seu título (ex. + ate a diluição 1:320) Quantitativo: informa quantidade absoluta do material detectado. ? IMPORTANTE : Finalidade do teste - 1.Triagem 2.Diagnóstico
Alguns fatores que afetam as medições das reações Ag/Ac Afinidade Avidez Taxas Ag-Ac Reações Cruzadas Anticorpos: Monoclonais Policlonais
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS Técnicas sem uso de marcadores Reações de Precipitação Reações de Aglutinação Técnicas com uso de marcadores ELISA Citometria de fluxo Imunofluorescência Radioimunoensaio
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS PRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese AGLUTINAÇÃO - Aglutinação direta e indireta - Inibição da aglutinação - Teste de Coombs IMUNOENSAIOS - Radioimunoensaio - ELISA - Imunofluorescência - Citometria de Fluxo PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
SENSIBILIDADE DE DIFERENTES TESTES DE IMUNODIAGNÓSTICO
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO ZONA DE EQUIVALÊNCIA EFEITO PRÓ - ZONA EFEITO PÓS - ZONA
IMUNODIFUSÃO DUPLA Utiliza uma matriz de ágar Ag + Ac = linha de precipitação visível Possui baixa sensibilidade ; demorado (18-24 hrs)
Coloca-se agarose sobre uma lâmina: Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo: Ac As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante Ac Ag Utilização da técnica : caracterizar antigenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenças auto-imunes
IMUNODIFUSÃO RADIAL Método de Mancini Interpretação Anticorpo no gel Antígeno no poço Vice-versa Ag Concentração Diameter2 Ag Ac no gel Interpretação Diâmetro do anel é proporcional à concentração do Ag
IMUNODIFUSÃO RADIAL Fácil, baixo custo Utiliza uma matriz de ágar É quantitativa Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas
IMUNOELETROFORESE Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitação. É qualitativo Utiliza lâminas recobertas com ágar + - Ag 1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna canaleta 2- Anti-soro na canaleta 3- Difusão e precipitação Útil para detectar gamopatias monoclonais, como mieloma múltiplo e a macroglobulinemia
IMUNOELETROFORESE
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO Pode ser direta ou indireta + sensíveis qtidade de Ac 500 vezes menorpartículas amplificam a reação Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-quantitativo) Agregação visível de partículas Eritrócitos Bactérias Fungos látex USO: Tipagem ABO Testes confirmatórios para sífilis, FR
AGLUTINAÇÃO DIRETA + Ac = Aglutinação Partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais na sua superfície + Ac = Aglutinação Hemácias Bactérias Protozoários Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO) 1) Amostra de sangue na placa teste: 3) Controle negativo: 2) Reagente (anticorpo anti A, B): 4) Mistura-se:
AGLUTINAÇÃO DIRETA 5) Leitura do resultado: negativo positivo Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste);
Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA) Ags solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias) Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa. O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa. Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço. Aglut + Aglut -
AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX: FATOR REUMATÓIDE Fator Reumatóide: Anticorpos que reconhecem epítopos presentes na fração cristalizável (Fc) da molécula de IgG. A maioria destes Acs são da classe IgM porém pode-se encontrar também Acs IgA e IgG. Enfermidades em que o encontro de FR é comum Teste: Visualização de aglutinação das partículas de látex revestidas pelo antígeno (no caso IgG humana ou de coelho) Causas virais HBV, HCV, Mononucleose, influenza, AIDS, pós vacinação Doenças auto-imunes Artrite Reumatóide, Lúpus Eritematoseo sistêmico, Esclerose sistêmica, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjörgren, cirrose biliar, hepatite auto-imune, etc Neoplasias Após irradiação ou quimioterapia Infecções bacterianas Tuberculose, sífilis, hanseníase, salmonelose, endocardite bacteriana subaguda, brucelose, borreliose Doenças parasitárias Malária, esquistossomose, filariose, tripanossomíase Interpretação: No caso de artrite reumatóide surge uma alta quantidade de FR de alta afinidade
TESTE DE COOMBS (Antiglobulina) DIRETO : Detecta Ac ligados a eritrócitos INDIRETO: Detecta Ac anti-eritrócitos no soro 1.Permite detectar incompatibilidade Rh - DHRN (mãe produz IgGantiRh). 2.R. medicamentosa 3.R. transfusional
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO Teste baseado na inibição da aglutinação devido a competição com antígeno solúvel. Resultado negativo:(ausência de hCG na urina): ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG. Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Princípio da técnica: Anticorpos ou antígenos são conjugados a um fluorocromo, que, quando excitado por radiações UV, emite luz no espectro visível. A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um microscópio de fluorescência Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). IFA direta: Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais, e doenças imunológicas renais e de pele. IFA indireta: pesquisa de antígenos ( plasmódio em hemácia) e de anticorpos ( sífilis, toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, doença de chagas, malária, etc)
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Treponema pallidum Tripanosoma cruzi Pneumocystis carinii Giardia lamblia
CITOMETRIA DE FLUXO ( célula medida em movimento ) Separação de células marcadas por fluorescência; Anticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD) Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. É um teste qualitativo e quantitativo. Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em uma corrente através de um feixe de Laser. CD 18 CD 4 CD 125 CD 147
CITÔMETRO DE FLUXO SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ. SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.
CD4 CD8 CD20
USO Determinar o tipo e no de céls. sanguíneas brancas Isolar populações celulares Quantidade, tamanho, granulosidade; Distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ags Tamanho celular.
APLICAÇÕES CLÍNICAS DA CITOMETRIA DE FLUXO - Análise da subpopulação linfocítica - Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas, HIV - Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo - Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas - Análise de reticulócitos - Detecção de anticorpos antiplaquetários - Quantificação de células progenitoras (Stem cells) - Avaliação imunológica de paciente transplantado
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. O produto final ação da enzima sobre o substrato = COR Produto final corado leitura em fotocolorímetro. Principais tipos de ELISA: indireto, direto e competitivo. Direto = Ag Indireto = Ac Vantagens do ELISA: -Utiliza reagentes estáveis -Teste de alta sensibilidade -Seguros e de baixo custo -Não trabalha com radioisótopos -pode ser adaptado tanto a testes simples quanto à automação -Não depende de formação de precipitado, aglutinado, etc.
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA Ac marcados com Enzimas + substrato = COR + Ag Qualitativos Quantitativos Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase DIRETO OU SANDUÍCHE INDIRETO
Ponte de corte (“ cut-off”) : é o limiar de reatividade; define o limite entre um teste negativo e um teste positivo
ESTE EXEMPLO É DE ELISA DIRETO OU INDIRETO?
CURVA PADRÃO - ELISA
RADIOIMUNOENSAIO - RIA Moléculas marcadas com isótopo ( I 125 ,I 131 ) Marcações: I125: emite raios gama H3: raios beta Desvantagem manipulação de isótopo radioativo.
RADIOIMUNOENSAIO
RADIOIMUNOENSAIO Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas (urina ou soro de atletas), etc. • Vantagens: – Alta sensibilidade – Permite medidas rápidas e precisas – Limiar de detecção em nanogramas e picogramas. • Desvantagens: – Custo – Vida média dos reagentes – Risco operacional (radiação)