Engenharia Genética

A molécula de DNA Intocável (1950-1975) A partir de década de 70, foi possível abri-la, extrair genes, transplantá-los, multiplicá-los Conhecer doenças humanas Transformar organismos… IL 2010

Como encontrar um gene? Como isolá-lo? Uso de enzimas de restrição Cortam a molécula de DNA em zonas específicas, sempre que as encontram. Presentes em bactérias, que as usam como mecanismo de defesa contra os vírus que as atacam (bacteriófagos). IL 2010

Enzimas de restrição Endonucleases de restrição Enzimas presentes nas bactérias que cortam a cadeia de DNA em zonas específicas – zonas de restrição Fragmentam o DNA em fragmentos mais pequenos que contêm na extremidade a sequência reconhecida. IL 2010

Enzima de restrição Eco RI Por exemplo a enzima Eco RI reconhece a sequência: 5´GAATTC3´ IL 2010

Enzima de restrição Eco RI Por exemplo a enzima Eco RI reconhece a sequência: 5´GAATTC3´ fará o corte entre o nucleótido de guanina e o nucleótido de adenina em cada cadeia. IL 2010 Extremidades coesivas

Ligases do DNA DNA Recombinante Molécula DNA 2 Permitem catalizar as reacções em que as extremidades livres são ligadas a novas sequências de DNA (novo gene) por complementaridade de bases. Molécula DNA 1 IL 2010 Molécula DNA 3

Técnica do DNA recombinante Cada fragmento de DNA, que foi separado do resto da molécula, contém um ou mais genes. Cada gene permite a síntese de uma proteína, por isso ao estudarmos o gene estamos a estudar a proteína que ele codifica. Isolando fragmentos de DNA (genes) podem transferir-se para outro organismo. Como fazer a transferência? IL 2010

Técnica do DNA recombinante “Vector” É necessário usar um vector, uma entidade que possa transferir o gene do organismo (de onde foi retirado) para o organismo que o vai receber Vectores mais importantes: plasmídio* de bactérias IL 2010 Os plasmídio é uma molécula de DNA circular não ligada ao cromossoma, e que se encontra no hialoplasma das bactérias. Multiplica-se a cada divisão celular, passando uma cópia para cada célula “filha”.

Técnica do DNA recombinante “Corte e isolamento do gene” A enzima de restrição corta o DNA do plasmídeo num ponto específico. A mesma enzima corta o DNA dador, de forma a isolar o gene que se pretende inserir no plasmídeo. IL 2010

Técnica do DNA recombinante “Introdução no plasmídeo” O gene a inserir é colocado em contacto com o plasmídeo, juntamente com ligases do DNA (enzimas). O gene passa a fazer parte do plasmídeo, que possui agora um DNA recombinante IL 2010

Técnica do DNA recombinante “Propagação” O plasmídeo recombinante em contacto com bactérias introduz-se em algumas delas. As bactérias portadoras do plasmídeo sintetizam agora a proteína desejada. Como saber quais as bactérias portadoras do DNA recombinante? IL 2010

Técnica do DNA recombinante “Selecção” Os plasmídeos usados possuem genes que lhes conferem resistência a determinados antibióticos. Num meio com determinado antibiótico, sobreviverão apenas as bactérias resistentes, e portanto portadoras do gene pretendido (com DNA recombinante). IL 2010

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Técnica do DNA recombinante “Aplicações” Estudos de mecanismos de replicação e expressão de genes Determinação da sequência de um gene (e proteína codificada) Aumento no rendimento de plantas Obtenção de organismos geneticamente modificados capazes de produzir substâncias úteis (ex.: insulina humana) … IL 2010

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Técnica do DNA complementar Para obtenção de insulina humana: Antes: Uso de insulina obtida a partir do pâncreas de vacas ou de porcos (provocava por vezes rejeição) Solução? Uso do RNAm existente nas células do pâncreas humano Recurso a uma enzima existente nos vírus: transcriptase reversa (catalisa a formação de DNA a partir de RNA) IL 2010

Formação de cDNA A molécula de RNAm, serve de molde à sintese de uma molécula de DNA (já sem intrões e por isso funcional) IL 2010

Formação de cDNA O gene isolado que codifica a síntese de insulina pode agora ser inserido numa bactéria e iniciar-se a produção industrial de insulina IL 2010

Reacções de polimerização em cadeia (PCR) Quando é necessária uma quantidade de DNA superior à disponível, como obtê-la? Casos que envolvem as ciências forenses Na década de 80, passou a utilizar-se a técnica do PCR para fazer milhares de cópias de um único segmento de DNA. IL 2010

PCR Técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA). Os primers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar.  IL 2010

PCR Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers diferentes IL 2010

PCR Obtêm-se uma amostra mínima de DNA de uma célula humana. A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleótidos de DNA e os primers complementares a sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio. Coloca-se o tubo de ensaio numa máquina de PCR (maquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e arrefecimento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa. IL 2010 Adaptado de http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/recombinante.php

PCR Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla cadeia) o DNA. Cada cadeia simples do DNA desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso submete-se a 54ºC onde os primers servem de iniciadores para a enzima polimerase. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase) para a duplicação da cadeia - ligação dos nucleotídos livres por complementaridade à cadeia de DNA ,formando assim uma nova cadeia dupla. Repete-se até obtenção da quantidade necessária. IL 2010 Adaptado de http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/recombinante.php

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