Colóquio de Fitotaxonomia

A biologia molecular na taxonomia Rui Vidal (FFUL) Filomena Nóbrega (EFN) Ana Monteiro (ISA) Colóquio de Fitotaxonomia Instituto Superior de Agronomia 5 de Junho 2001

O início da Biologia Molecular  Estuda as bases moleculares da vida  Relaciona as estruturas das biomoléculas com as funções específicas que desempenham na célula e no organismo. O início da Biologia Molecular Foi em 1953, com a apresentação do modelo estrutural do DNA por Francis Harry Compton Crick e por James Watson

Importância da estrutura do DNA Suporte universal da informação genética transmitida de geração em geração A estrutura do DNA mostra como acontece essa transmissão

Dogma central da biologia molecular A partir do DNA é sintetizado o RNA e a partir deste sintetizam-se proteínas Dogma central da biologia molecular

A estrutura dos genomas vegetais Genoma nuclear (nDNA) 1,1×106 a 110×109 Kbp dsDNA linear Armazena o material hereditário da célula (DNA) Coordena as actividades da célula Fonte da maior parte dos genes que codificam proteínas A maior parte dos genes são membros de famílias de genes Hereditariedade biparental

A estrutura dos genomas vegetais Genoma mitocondrial (mtDNA) 200-2500 Kbp A estrutura dos genomas vegetais dsDNA circular fechado Maior diversidade dimensional Hereditariedade uniparental Baixos padrões de divergência (muito conservado) Recombinações rápidas Grande variabilidade dimensional

A estrutura dos genomas vegetais Genoma cloroplástico (clDNA ou cpDNA) 135-160 Kbp A estrutura dos genomas vegetais dsDNA circular fechado O mais utilizado Relativamente estável no tamanho e na ordem dos genes Elevado número de cópias Alguns genes são de evolução lenta e outros de evolução mais rápida Regiões espaçadoras/intrões podem variar entre espécies relativamente próximas ou mesmo entre populações Hereditariedade uniparental: normalmente materna nas angiospérmicas e paterna nas gimnospérmicas

Moléculas que caracterizam determinada célula ou organismo MARCADORES Moléculas que caracterizam determinada célula ou organismo Genética Existência de variação Custo Registo de fósseis Homologia Evolução convergente Morfológicos Bioquímicos Genéticos

Marcadores Morfológicos Marcadores controlados por genes associados a caracteres morfológicos, em geral características fenotípicas de identificação visual Número reduzido de marcadores morfológicos Baixo nível de polimorfismo Somente identificados, na sua maioria, ao nível da planta adulta

Fenótipos moleculares resultantes da expressão de um ou mais genes Marcadores Bioquímicos Fenótipos moleculares resultantes da expressão de um ou mais genes Proteínas Metabolitos secundários Fitoquímica Isoenzimas Proteómica Têm elevado nível de polimorfismo São específicos do ciclo vegetativo das plantas

Isoenzimas Múltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorre numa espécie, como resultado da presença de mais de um gene que codifica a mesma enzima Desempenham a mesma actividade catalítica Podem ter diferentes propriedades cinéticas e ser separadas por processos bioquímicos As enzimas de um mesmo grupo diferem entre si na sequência de aminoácidos que possuem A premissa básica é que diferenças na mobilidade de isoenzimas num campo eléctrico são resultantes de diferenças ao nível de sequências de DNA que codificam tais enzimas Base genética

Detecção de marcadores isoenzimáticos A actividade enzimática é detectada in situ através de reacções de coloração histoquímica, como, por exemplo, a formação de um produto corado e insolúvel, visualizando-se num gel diferentes bandas

Utilização de Isoenzimas Avaliar os níveis de variabilidade genética de populações naturais Estudar o fluxo génico entre populações e processos de hibridação natural Estudo da dispersão de espécies Análise de filogenias Identificação de variedades

Regiões de DNA que caracterizam a célula ou organismo Marcadores Genéticos Regiões de DNA que caracterizam a célula ou organismo Complexidade dos genomas eucariotas Cell and Molecular Biology (Karp, G.)

Nuclear (nDNA) Mitocondrial (mtDNA) Cloroplástico (clDNA) Marcadores Genéticos Nuclear (nDNA) Mitocondrial (mtDNA) Cloroplástico (clDNA) Basais Não Basais DNA telomérico (nuclear) Regiões codificantes dos rRNAs (rDNAs) Regiões espaçadoras dos rRNAs (ITS) Regiões de expressões genómicas (ETS) Regiões codificantes de isoenzimas e/ou aloenzimas stDNA (satélites) Repetições em série de número variável (VNTR) Elementos transponíveis (TEs)

DNAs satélites propriamente ditos Extra-cromossomais Intra-cromossomais Minisatélites (10-60 bp) Microsatélites (1-5 bp) DNAs satélites propriamente ditos Centrómeros Sequências repetitivas agrupadas ou dispersas ao longo do genoma nuclear

Elementos transponíveis (TEs) Regiões de DNA que podem saltar para outro local no mesmo cromossoma ou para outro cromossoma Classe I Retroposões (retroPns) Classe II Transposões (Tns) Retrotransposões (RetroTns) Intrões do grupo II Plasmídeos mitocondriais de leveduras Autónomos Não autónomos MITE (miniature inverted repeat transposable element)

Elementos transponíveis (TEs) Barbara McClintock Transposição/Transposões Transposões (Tns) autónomos e não autónomos LTIR (long terminal inverted repeat) STIR (short terminal As extremidade do elemento transponível contêm sequências repetidas No local de inserção do transposão há duplicação da sequência alvo Transmissão vertical (estáveis ao longo das gerações celulares) Transmissão horizontal (instáveis) Transposões são específicos para células ou organismos

Elementos transponíveis (TEs) Retrotransposões (retroTns) copia gypsy LINEs SINEs LTR (long terminal repeat) Não - LTR Síntese de um RNA intermédio Transcriptase inversa Promovem duplicação da sequência alvo Agrupados em famílias Não se inserem em genes funcionais Transmissão vertical (estáveis) Transmissão horizontal (poucos casos) Retrotransposões são específicos para a família, géneros, espécies, sub-espécies ou variantes de células ou organismos

Elementos transponíveis (TEs) Retrotransposões (retroTns) copia gypsy LINEs SINEs LTR (long terminal repeat) Não - LTR Síntese de um RNA intermédio Transcriptase inversa Promovem duplicação da sequência alvo Agrupados em famílias Não se inserem em genes funcionais Transmissão vertical (estáveis) Transmissão horizontal (poucos casos) Retrotransposões são específicos para a família, géneros, espécies, sub-espécies ou variantes de células ou organismos

Marcadores Genéticos Basais Não Basais Nuclear (nDNA) Mitocondrial (mtDNA) Cloroplástico (clDNA) Basais Não Basais DNA telomérico (nuclear) Regiões codificantes dos rRNAs (rDNAs) Regiões espaçadoras dos rRNAs (ITS) Regiões de expressões genómicas (ETS) Regiões codificantes de isoenzimas e/ou aloenzimas stDNA (satélites) Repetições em série de número variável (VNTR) Elementos transponíveis (TEs) Regiões espaçadoras dos rRNAs (ITS e ETS)

Metodologias Físico-Químicas Enzimáticas Clonagem Sequenciação

Metodologias Físico-Químicas Hibridação Electroforese em géis

PCR Metodologias Físico-Químicas Hibridação Em solução Suporte sólido Reacção de polimerase em cadeia Southern blotting (DNA) Northern blotting (RNA) Western blotting (Proteínas)

Polimorfismos de DNA amplificados ao acaso PCR Polimorfismos de DNA amplificados ao acaso (RAPD)

Polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados PCR Polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLP)

PCR Metodologias Físico-Químicas Hibridação Em solução Suporte sólido Transferência e fixação de fragmentos de DNA em membranas Em solução Suporte sólido PCR Reacção de polimerase em cadeira Southern blotting (DNA) Northern blotting (RNA) Western blotting (Proteínas)

Polimorfismos no comprimento de fragmentos de restrição Southern blotting Polimorfismos no comprimento de fragmentos de restrição (RFLP)

Metodologias Físico-Químicas Electroforese em géis AGE PAGE Ribotipia Normal PFGE Unidimensional (1-D) Bidimensional (2-D)

Electroforese AGE

Electroforese PAGE (1-D)

Electroforese PAGE (2-D)

PCR Metodologias Enzimáticas Sequenciação Clonagem Via celular Via química Amplificação PCR Enzimática Celular Reacção de polimerase em cadeia Clonagem

Selecção do tipo de marcador mais apropriado Características do marcador Isoenzina RFLP RAPD AFLP Sequenciação Reprodutibilidade ++ +++ Facilidade técnica + Tempo de desenvolvimento curto médio Custos do equipamento baixo alto Custos dos ensaios baixo médio Adequação para análise filogenética média muito alta

Selecção do tipo de marcador mais apropriado Parâmetros de decisão Nível de informação da diversidade Nível de variação esperada ou indicada Acessibilidade de sondas e "primers" Tempo necessário ao desenvolvimento do ensaio Investimento operacional e financeiro

Selecção do tipo de marcador mais apropriado Classificação biológica Reino Divisão Classe Ordem Família Género Espécie Regiões de DNA codificante de rRNAs Regiões de DNA codificante de proteínas Regiões de DNA não codificante

Biologia Molecular no Século XXI Genómica Proteómica

Acumulação exponencial de sequências Genómica Análise global, via informática, dos genomas e dos genes a partir das sequências depositadas em bancos de dados, tendo em vista o rastreio e a elucidação dos mais variados marcadores e "sinais" que controlam as expressões génicas como também a estrutura e a organização dos genomas Actualmente o GenBank contém registados mais de 11 biliões de bp de cerca de 100.000 espécies Acumulação exponencial de sequências

Genómica Genómica Funcional Genómica Estrutural Tecnologias já desenvolvidas Genómica Funcional Estudo das funções dos genes e das proteínas Bioinformática Genómica comparativa Genómica Estrutural Estudo das semelhanças e diferenças contidas nas sequências de genomas diferentes ou das proteínas por estes codificadas FISH "Fluorescence in situ hybridization" Fibras de DNA "Chips" de DNA

Genómica Estrutural A elucidação das organizações dos genomas fomentou o conceito de que só as proteínas, ou seja, os produtos expressos dos genomas, é que são os elementos responsáveis pela viabilidade das células Mais importante Estudar o conjunto total das proteínas (proteoma) que são expressas num determinado período de vida das células e dos organismos

Proteómica Proteómica de Expressão Proteómica Quantitativa Estuda e detecta as mudanças globais da expressão génica Proteómica Quantitativa Estuda e detecta o equilíbrio das expressões génicas assim como das alterações induzidas por perturbações Proteómica de Mapeação Celular Estuda e detecta sistematicamente as interacções proteína-proteína Se e quando os produtos génicos proteicos são expressos Qual ou quais o(s) grau(s) de modificação após síntese dos produtos génicos proteicos Quais as concentrações relativas dos produtos génicos proteicos

Genómica Proteómica Epigenética Sintenia Estuda as alterações hereditárias na expressão génica sem que ocorra qualquer alteração nas sequências genómicas Estudo da ocorrência de 2 ou mais locus conhecidos no mesmo cromossoma, tendo em vista responder a questões de homologia residual entre cromossomas completamente homólogos nas suas origens

A importância da biologia molecular na taxonomia de plantas é enorme, com múltiplas facetas e com especial incidência na resolução de algumas situações ambíguas

A biologia molecular na taxonomia Rui Vidal (FFUL) Filomena Nóbrega (EFN) Ana Monteiro (ISA) Colóquio de Fitotaxonomia Instituto Superior de Agronomia 5 de Junho 2001