QBQ 0102 – Educação Física Carlos Hotta Tecnologia do DNA recombinante 18/06/13

A Tecnologia do DNA recombinante A tecnologia do DNA recombinante nos permite manipular sequências de DNA e introduzi-las em novos organismos

1975 – Escherichia coli capaz de produzir proteína de Salmonella

Polimerase Chain Reaction

Gel de agarose O DNA é negativo e é atraído pelo pólo positivo do aparato; A malha de agarose atrapalha a migração de moléculas maiores, que acabam migrando mais devagar no gel; O DNA é visualizado com marcadores fluorescentes e o tamanho produzido é estimado com a adição de marcadores com o tamanho conhecido.

Plasmídeos Plasmídeos são DNA circulares, muito menores que um cromossomos circular, que podem complementar as sequências do genoma da bactéria Plasmídeos são capazes de se auto-replicar e podem apresentar múltiplas cópias em uma só célula Plasmídeos geralmente possuem: origem de replicação, um local de múltiplos sítios de restrição, um gene de resistência a antibiótico

Enzimas de restrição cortam o DNA Enzimas de restrição são endonucleases com capacidade de cortar o DNA em sequências específicas Geralmente reconhecem palíndromos no DNA Não nomeadas de acordo com seu organismo de origem -> Escherichia coli

Enzimas de restrição podem gerar pontas coesivas ou pontas cegas

Há centenas de enzimas de restrição diferentes

Ligação

Transformação Bactérias podem incorporar um plasmídeo por choque térmico ou eletroporação No choque térmico há a incorporação de DNA após um tratamento rápido a 37oC a 42oC. Na eletroporação, um pulso de alta voltagem faz com que a memebrana da bactéria permita a entrada dos plasmídeos.

Mas como usar genes de eucariotos em procariotos?

A transcriptase reversa transforma o RNA em DNA A transcriptase reversa nos permite tornar o RNA novamente em DNA (cDNA) O cDNA é mais estável que o RNA e pode ser usado em reações de PCR Geralmente as sequências obtidas são de RNA maduro

Animais e plantas transgênicas Transgênicos são organismos que tiveram seu genoma alterado utilizando-se a tecnologia do DNA recombinante A agricultura convencional vêm introduzindo genes novos nos organismos faz anos

Como se gera animais transgênicos?

A Agrobacterium tumefaciens é capaz de tarsnferir sequências definidas para o genoma das plantas

Sequenciamento de DNA usa di-deoxi nucleotídeos

Sequenciamento de DNA usavam 4 reações distintas de replicação

Atualmente usa-se dideoxi nucleotídeos com marcadores fluorescentes Automatização permite sequenciar 96 sequências por vez, 8 a 12 vezes por dia 96 x 10 x 1000 = 960 mil pb por dia!

Novas técnicas de sequenciamento permitem a obtenção de milhões de sequências simultâneas Pode-se obter o mesmo número de sequências que no Projeto Genoma em questão de dias Existem diversas técnicas envolvidas que geram diversos tipos de sequências (de 50 pb a 10000pb) em diversas quantidades (de milhares a centenas de bilhões) Como analisar? A busca é a do genoma humano por U$1000 -> cada pessoa no planeta pode ter seu próprio genoma sequenciado! Por quê sequenciar?

O 454 é um (velho) sequenciador de nova geração

O pirosequenciamento mede a luminescência produzida quando um deoxinucleotídeo é incorporado

O segredo está na capacidade de isolar, amplificar e sequenciar milhões de sequências em paralelo