Proteômica Universidade Federal de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Centro de Ciências Biológicas Programa de Bolsas REUNI Proteômica Florianópolis, 23 de novembro de 2010

Proteômica A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um genOMA. Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo, podendo caracterizar processos biológicos e permitem a descrição de mecanismos celulares.

Proteômica Tempo Núcleo Citoplasma Espaço Membrana Proteômica é a técnica utilizada para identificar todas as proteínas expressas por um genoma em um determinado tempo/espaço com o principal objetivo de elucidar os produtos gênicos a nível protéico. Tempo Núcleo Citoplasma Espaço Membrana

Proteômica Proteômica Proteômica sistemática: mapa protéico Tecidos Células Compartimentos celulares Proteômica diferencial: faz análise das modificações a nível protéico comparativamente com proteínas de referência Desenvolvimento Interações entre microorganismos e hospedeiros Tratamentos

Áreas de pesquisa : Caracterização do câncer

Área de pesquisa : Neuroproteômica – Caracterização do cérebro humano 2008 Proteoma de hipocampo de rato sob exercício 1999 Proteoma do cérebro de camundongo 2004 Proteoma de hipocampo humano 2005 Proteoma do complexo NMDA de camundongo em resposta à fármacos 2001 Foi proposto pela HUPO a caracterização do Proteoma humano sob condições normais e patológicas 2006 Proteoma do hipocampo de camundongo 2005 Proteoma do cérebro de rato 2005 Proteoma de M.P de hipocampo de camundongo

Revistas

Etapas metodológicas

Principais etapas metodológicas Tratamento do animal Extração das proteínas Focalização isoelétrica Eletroforese em gel 2-DE Digestão in gel Espectrometria de massa

Isolamento de proteinas

Lise da célula, proteção contra proteólise e fracionamento. Extração da amostra Precipitado é re-extraído Lise da célula, proteção contra proteólise e fracionamento. Estratégias a serem tomadas: manter a amostra na menor temperatura possível e utilizar o protocolo mais simples para evitar perda protéica. Tampão de lise: 25 mM Tris HCl pH 7,2 10 mM CHAPS 0,5 M NaCl 5% glicerol (v/v) 1 mM PMSF Lise mecânica da célula Homogenato de ptns em gelo por 20 min Centrifugação 30 min a 12000 x g a 4º C SN1+ SN2 Proteínas nucleares Proteínas citoplasmáticas Proteínas membranares

Quantificação das proteínas com 2D Quant Kit MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS : Bradford, Biureto, Lowry e Smith ou BCA. Solução com Íon cúprico (Cu+1) Proteínas totais Cu+1 Cu+1 Cu+1 Cu+1 Cu+1 Agente colorimétrico Cu+1 480 nm

Limpeza da amostra com Clean up Kit MÉTODOS BCA: Solução precipitante Ressuspensão das ptns em 250uL tampão de reihidratação: 7 M Uréia 2 M Tiuréia 2%(p/v) CHAPS 0.5% de IPG buffer pH 3-10 18 mM DTT 0,001% azul de bromofeno 100 ug /ul de proteína Pellet de Proteína pura Centrifugação Baseada na precipitação por TCA Diversas moléculas são eliminadas: DNA, lipídeos - Sais, detergentes

Solubilização da amostra Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia Agentes Surfactantes: CHAPS Agentes redutores: DTT

Hidratação do strip Tiras de strip de 13 cm imobilizado com pH 3-10

Focalicalização isoelétrica (IEF) Strips foram removidos Cerâmica IEF Strips foram posicionados Paper Pads umedecidos Ajuste dos eletrodos Total: 15500 V/h e 25 uA/strip Ettan IPGphor 3

Eletroforese em gel bidimensional (2D) 1º DTT Gel poliacrilamida 12,5% Cuba vertical Hoefer SE Ruby Separação das proteínas por pI 2º Iodoacetamida Fixação: 8% de ácido fosfórico, 50% de etanol por 1 hora Coloração: Coomassie Blue G-250 por 24h Separação das ptns por massa Proteínas separadas por pI e massa

Separação de proteínas com eletroforese em gel 2D Análise simultânea de diversas proteínas . Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes.

Análise das imagens no gel Volume dos spots: permitindo uma quantificação relativa Presença ou Ausência de spots Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais)

Digestão in gel Excisão dos spots Tripsinização Descoloração: 25 mM bicarbonato de amônio e 50% acetonitrila Tripsinização (entre os resíduos de lisina e arginina) Extração de petídeos: 50% de acetonitrila e 5% trifluoroacético Peptídeos são secos à vácuo Estocagem a -20ºC

Identificação das proteínas por Espectrometria de Massa Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos. Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas. Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações pós-traducionais das proteínas. Sistema à vácuo Amostras 2-DE Fonte de ionização Analisador de massa Detector

Espectômetro de Massa Peptídeos são homogenizados com pequenos compostos orgânicos Estes compostos reagem com a matriz orgânica ácido -ciano-4-hidroxicinâmico Peptídios são ionizados Os íons são dessorvidos

Espectômetro de Massa Os íons são acelerados alcançando alta energia cinética Colisão dos íons ao detector As massas dos fragmentos são separadas e detectadas As massas digeridas dos peptídeos são comparadas com uma lista de massas teóricas de peptídeos oriundas das ORFs do banco de dados do genoma de um organismo

Espectômetro de Massa Identificação de cada proteína do mapa proteômico

Proteômica

Array-based protein interaction detection

Array-based protein interaction detection

Protein microarrays

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