Engenharia do DNA María Julia Barison BMP-5777 Biologia Molecular e Bioquimica de proteínas alvo a drogas do parasita da malária humana Plasmodium falciparum USP - 2012

DNA recombinante: qualquer molécula de DNA composta de sequencias derivadas de diferentes organismos. Organismos geneticamente modificados (OGMs): qualquer organismo gerado a partir da introdução de DNA recombinante. Aplicações: Medicina Produção de hormônios como insulina ou fatores de crescimento Produção de vacinas Pesquisa Produção de proteínas recombinantes knock-out e superexpressão de genes para estudos funcionais Estudos de expressão e localização subcelular (genes repórteres) Melhoramento animal e vegetal (OGMs)

1. Fragmento de DNA de interes + Vetor 2. DNA recombinante 3. Replicação do DNA recombinante em células hospedeiras 4. Isolamento, sequenciamento e manipulação do fragmento de DNA purificado

1. Fragmento de DNA de interes + Vetor PCR DNA Livrarias de DNA Plasmídeo Origem de replicação (ORI) Marcador de seleção (resistência a ATB) Polylinker (sítios de corte únicos para diferentes ER) Bacteriófago Lambda/Cosmidos BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) YAC VETOR Molecular Cell Biology, 5ta edição

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO *Extremos produzidos pelas enzimas tipo II: Tipo Estrutura Cofatores Sítio de reconhecimento Sítio de corte Tipo I Multifuncional, várias subunidades Mg2+, ATP, AdoMet Asimétrico Aleatóriamente, a distância médias de 1000 pb. Tipo II Restrição e modificação em enzimas diferentes Mg2+ Palindrómicos Dentro da sequencia de reconhecimento*. Tipo III Mg2+, ATP, A uma distância de 25-27 pb da seq de reconhecimento. *Extremos produzidos pelas enzimas tipo II: Bickle and Krüger (1993); Molecular Cell Biology, 5ta edição

LIGASES OUTRAS ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM Vetores tipo T - ligação Clonagem por recombinação

Replicação do DNA recombinante em células hospedeiras Transformação: Shock térmico Electroporação 4. Isolamento, sequenciamento e manipulação do fragmento de DNA purificado Molecular Cell Biology, 5ta edição

MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA Tipos de mutação: Pontual Deleção Inserção Mutação Pontual Sem Mutação Silenciosa Nonsense Missense conservativa Não -conservativa

ESTRATÉGIAS Sequencia de interes Introdução da mutação desejada + sítio de restrição Introdução da mutação desejada Sequencia de interes Primer que introduzirá ou eliminará um sítio de restrição Sítio de restrição que permitirá o screening de clones mutantes Se um sitio foi eliminado, ele pode ser utilizado para aumentar a proporção de clones mutados.

Sistema pALTER

Mutagênesis sítio dirigida mediante Overlap Extension PCR Clonagem Desnaturação Amplificação Re-hibridação Extensão Ho, S. N et al (1989)

Screening dos clones mutados: Análise por digestão com enzimas de restrição Identificação do clone por hibridação com sonda marcada Colonias de bacterias levando o plasmídeo mutado Membrana de nitrocelulosa Incubação da membrana com solução alcalina DNAss unido à membrana Hibridação com sonda marcada Sinal positivo Adaptado de Molecular Cell Biology, 5ta edição

Obrigada pela atenção!!...