INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO Dayse Locateli 2005

Ligações não covalentes: Pontes de Hidrogênio Ligações iônicas Interações hidrofóbicas Interações de Van der Waals Interação reversível Complementariedade Especificidade

Força de interações total entre Ac e Ag. Afinidade Força de interação entre um único sítio de ligação Ag-Ac (em um único epítopo). Avidez Força de interações total entre Ac e Ag. Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos Reação cruzada Dois Ag diferentes apresentam um epítopo idêntico Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não relacionado, mas com propriedades químicas similares.

Aplicações Pesquisa Diagnóstico Soroepidemiológia Métodos: Precipitação Aglutinação Imunoensaios

Metodologias que utilizam: Reagentes não marcados Reação de precipitação Reação de aglutinação 2) Reagentes marcados RIA ELISA Imunofluorescência Western Blot

Reagentes não marcados Detectam / quantificam as conseqüências da ligação Ag – Ac

Reação de Precipitação Interação: ac - ag solúvel forma uma rede que pode desenvolver um precipitado visível. Reação de Precipitação Anticorpos bivalentes + Antígenos multivalentes PRECIPITADO

1- Reação de precipitação em soluções Reação quantitativa: Qtidade cte Ac Qtidade cresc. Ag Qtidade precipitina

2 - Reação de Precipitação em gel Utiliza uma matriz de ágar Ag + Ac = linha de precipitação visível a) Imunodifusão radial (Método de Mancini) Ag ou Ac fixos Dosagem de proteínas séricas b) Imunodifusão dupla Identidade de Ags = Ac de reatividade conhecida

Reações de Aglutinação Ac + Ag particulado aglutininas Agregação visível de partículas Efeito pró-zona Eritrócitos Bactérias Fungos látex

Aglutinação Direta Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação Detecção Acs específicos Quantificação Tipagem ABO Testes confirmatórios para sífilis Aglutinação bacteriana Presença de infecção Diferenciação de espécies

Aglutinação passiva Ag solúveis associados a outras superfícies + (Partículas de látex ou superfície de hemácias) +

Inibição da Aglutinação

Reagentes Marcados Detectam / quantificam diretamente a ligação Ag - Ac

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA Ac marcados com Enzimas + Ag + substrato (incolor) = COR Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase Qualitativos Quantitativos Direto = Ag Indireto = Ac

ELISA Indireto ELISA Direto ou Sanduíche

ELISA Competitivo Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo

Imunofluorescência

Ac + Fluorocromo  luz  Ac + fluorocromo r ght

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Reagentes secundários: Anticorpo secundário marcado com fluorocromo proteína A marcada com fluorocromo = porção Fc das IgGs

Isotiocianato de fluoresceína (FITC) VERDE Ficoeritrina (FE) VERMELHA

Identificar subpopulações de linfócitos Aplicações: Identificar subpopulações de linfócitos Identificar espécies bacterianas localização de hormônios Detecção complexos ag-ac em doenças auto-imunes Detecção anticorpos anti-DNA Teste qualitativo

Citometria de Fluxo Separação de células ativadas por fluorescência Anticorpos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD) Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente Teste qualitativo e quantitativo CD 18 CD 4 CD 125 CD 147

Tamanho Granulosidade Fluorescência

Determinar o tipo e no de céls. sanguíneas brancas Aplicações: Determinar o tipo e no de céls. sanguíneas brancas isolar populações celulares distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ag o tamanho celular. CD4 CD8 CD20 Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes HIV , Leucemias

Western Blotting Eletroforese de proteínas Diferença de tamanho (PM) Mobilidade da proteína Detecção Ag ou Ac

Western Blotting Gel membrana de transferência papel filtro preenchimento tela de suporte Gel/ membrana/ filtro Separação e detecção de proteínas Identificação de Ac específico Ac radiomarcado ou Ac sec. ligado a enzima Tampão ( +) ( - )

Radioimunoensaio RIA Hormônio proteínas séricas drogas vitaminas Ac Moléculas marcadas com ISÓTOPO 0,0001 microgramas/ mL

Testes que necessitem de alta sensibilidade Marcações: I125: emite raios gama H3: raios beta Aplicações: Testes que necessitem de alta sensibilidade Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue Pesquisa Desvantagem: Não é um teste seguro!