PESQUISA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO NO CARCINOMA MAMÁRIO INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DO GENE TP53 NO CÂNCER DE MAMA E NAS LESÕES MAMÁRIAS PRÉ-NEOPLÁSICAS

Câncer de Mama

Câncer de Mama No mundo: segunda neoplasia maligna USA: 180 mil novos casos por ano uma em cada oito mulheres Parkin et al, Eur J Cancer 2001. National Center for Health Statistics, 1998.

Câncer de Mama no Brasil Principal causa de morte por câncer em mulheres Previsão para o ano de 2003: casos novos: 41.610 (46,35/100.000 mulheres) óbitos: 9.335 (10,40/100.000 mulheres) INCA, 2003

Mortalidade por Câncer no Brasil de 1979-2003

Câncer de Mama no Brasil RS: terceiro do país em incidência 52,2 casos novos/ 100.000 mulheres RJ: 103,89 /100.000 SP: 78,69/100.000 INCA, 2003

Etiologia Etiologia desconhecida Fatores hereditários = 5% Vários fatores de risco Patogênese complexa Estudos para definição etiológica

Lesões Mamárias Pré-neoplásicas Precursoras do carcinoma mamário Modelo de evolução ainda indefinido alterações genéticas favoráveis Syngletary, J Am Coll Surg 2002

Lesões Mamárias Pré-Neoplásicas Hiperplasia epitelial típica (risco 2 vezes maior) Hiperplasia epitelial atípica (risco 5 vezes maior) Carcinoma in situ (risco 10 vezes maior) Page et al, J Natl Cancer Inst 1978; London, JAMA 1992; Dupont, Cancer 1993

PAPILOMAVÍRUS HUMANO Vírus DNA Mais de 100 tipos identificados Tipos são classificados conforme homologia na seqüência de DNA e associação com lesões clínicas Sisk & Robertson, Front Biosci 2002

PAPILOMAVÍRUS HUMANO Mucosos: 11, 6, 16, 18, 31, 33, 52 Epidermodisplasia verruciforme: 14, 19, 29, 46 Cutâneos: 1, 63, 60, 65, 41 zur Hausen & Villiers. Annu Rev Microbiol 1994

Vias de infecção Contato/ Sexual Transplacentária Hematogênica Strauss et al. Sex Trans Infect 2002; Syrjanen &Puranen. Crit Rev Oral Biol Med 2000

Formas de infecção Latente Proliferativa Oncogênica

Ação do HPV na célula Lesões benignas - epissomal Lesões malignas- freqüentemente integrado ao genoma do hospedeiro Aumento da expressão dos genes E6 e E7 Wolf & Ramirez, Cancer Invest 2001

Mecanismo oncogênico do HPV E6 - degrada a proteína p53 pela via da ubiquitina p53: parada do ciclo celular e/ou apoptose sempre que há um dano no DNA Farthing & Vousden, Trends in Microbiol 1994

Mecanismo oncogênico do HPV E7 - modifica a estrutura da proteína Rb pRb = responsável pela manutenção do ciclo celular quiescente. Acúmulo de mutações genéticas e imortalização celular Sisk & Robertson, Front Biosci 2002

Papel oncogênico do HPV Fator causal essencial para o desenvolvimento de neoplasia do colo uterino Detecção de DNA viral em 99,7% dos casos International Agency for Research on Cancer, 2000

Papel oncogênico do HPV Importante fator de risco para outras neoplasias da região anogenital: 50 % Câncer anal: incidência de 88 % Sturgeon et al. Am J Obstet Gynecol 1996; Frisch et al. N Engl J Med, 1997

HPV e carcinoma mamário Presença de DNA do HPV16 em 46% das 38 pacientes com carcinoma mamário e história prévia de NIC III Possível disseminação hematogênica viral Hennig et al. Breast Cancer Res and Treat, 1999

PCR Processo que inclui três etapas: Desnaturação Anelamento Extensão Amplificação exponencial do fragmento alvo

PCR Iniciadores ou primers: seqüência conhecida de oligonucleotídeos com 20-25 pares de bases Primer consenso: MY09/MY11, amplifica L1 amplifica mais de 25 tipos de HPVs menor sensibilidade do que os primers específicos Primer específico: amplifica região específica de um determinado HPV (E6)

Metodologia Análise dos resultados: gel de agarose a 1,5 % Visualização com luz ultravioleta a partir da incorporação de brometo de etídio primers consenso: 450 pares de base (pb) primers específicos: 380 pb para HPV16 e 440 bp para HPV 18 primers ß-globina: 280 bp

Resultados 101 pacientes com câncer de mama 41 pacientes controles 21 pacientes com fibroadenoma 20 pacientes com hiperplasia gordurosa

Resultados 25 casos de carcinoma positivos (24,75%) 15 casos (60%): positivos para HPV16 11 casos (40%): positivos para HPV18 Um dos casos foi positivo para os dois tipos virais Nenhum caso do grupo controle foi positivo para HPV

Gene TP53 Cromossoma 17p13 Li-Fraumeni proteína p53: apoptose e/ou parada do ciclo celular alteração: instabilidade genômica Malkin et al, Science 1990; Dickson & Lippman, Diseases of the Breast 2000.

Polimorfismo do gene TP53 Aumento de risco para o desenvolvimento de carcinomas Polimorfismo: ocorrência de múltiplos alelos num lócus, onde pelo menos dois alelos aparecem com freqüências superiores a 1% em determinada população

Polimorfismo do códon 72 do exon 4 Translação de uma Arginina (Arg) ou uma Prolina (Pro) - CGC/ CCC Maltlasheweski et al, Mol Cell Biol 1987; Wang et al Int J Mol Med 1999

Variante Arg mais efetiva na promoção da apoptose Alteração estrutural Mudanças funcionais Variante Arg mais efetiva na promoção da apoptose Aumento de susceptibilidade à degradação pela proteína E6 do papilomavírus humano (HPV) Maltlasheweski et al, Mol Cell Biol 1987; Dumont et al, Nat Genetics 2003; Thomas et al, Mol Cell Biol 1999.

Variações étnicas e climáticas Alelo Pro: variações de freqüência de 17 a 63% Mantido por seleção natural Beckman et al, Hum Hered 1994.

Carcinomas associados ao polimorfismo do TP53 Aumento de risco para portadores do alelo Pro: - cabeça e pescoço - pulmão Aumento de risco para portadores do alelo Arg: - bexiga - pele não-melanoma Weston et al, Cancer Epidemiol Biomark Prev 1992; Shen et al Cancer Lett 2002; Soulitzis et al Cancer Lett 2002

Associação mais significativa HPV: carcinoma de colo de útero Risco 7 vezes maior de desenvolver carcinoma Alelo Arg Storey et al, Nature 1998

Estudos posteriores com resultados controversos No Brasil apenas um estudo Associação de risco importante - Arg OR: 8,0 (95% CI: 2,3-28,5) OR: 21,5 (95% CI: 3,4-137, 8) Variação inter-laboratorial Makni et al, Int J Cancer 2000.

Câncer de Mama Sete trabalhos na literatura indexada Resultados controversos Tendência de aumento de risco com alelo Pro Kawajiri et al, Carcinogenesis 1993; Sjalander et al, Carcinogenesis 1996; Weston et al, Cancer Epidemiol Biomark Prev 1999; Papadakis et al, Mol Cell Biol Res Commun 2000; Keshava et al Cancer Epidemiol Biomark Prev 2002; Langerod et al Cancer Epidemiol Biomark Prev 2002; Suspitsin Int J Cancer 2003; Buyru Oncol Rep 2003.

Justificativas Ausência de trabalhos que determinem o tipo de polimorfismo da população brasileira Primeiro a ser realizado em lesões pré-neoplásicas Alta incidência de infecção pelo HPV e de carcinoma mamário na nossa região Estudo prévio: prevalência da infecção pelo HPV de 25% no câncer de mama em nosso meio

OBJETIVOS Objetivo principal avaliar a presença do polimorfismo do códon 72 no exon 4 do gene TP53 nas pacientes portadoras de carcinoma mamário e nas pacientes portadoras de lesões mamárias pré-neoplásicas

Objetivos secundários correlacionar o polimorfismo do gene TP53 com as seguintes variáveis clínico-patológicas: idade raça antecedentes ginecológicos tipo histológico grau histológico estadiamento tumoral presença de HPV no carcinoma mamário comparar o polimorfismo do gene TP53 nas pacientes com câncer com os achados em pacientes com lesões mamárias pré-neoplásicas e controles saudáveis.

Grupo controle indivíduos doadores do Banco de Sangue da ISCMPA sexo feminino randomização pela idade

Amostras Veno-punção: pacientes doação: controles 2 ml sangue total vacutainer com citrato de sódio extração do DNA das amostras

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO DE FRAGMENTOS POLIMÓRFICOS ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO SEPARAÇÃO POR ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE LEITURA EM LUZ U-V

Enzimas de restrição Enzima BstUI Prolina não clivada 199 pb Arginina clivada em 2 fragmentos 113 pb 86 pb