Identificação de microrganismos por testes bioquímicos 3/25/2017 Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana I Identificação de microrganismos por testes bioquímicos Prof. Fabricio Rochedo Conceição fabricio.rochedo@ufpel.edu.br fabriciorc@pop.com.br 4 de novembro de 2010

IMPORTÂNCIA Identificação de microrganismos; Tratamento; Epidemiologia – fontes de infecção - rastreabilidade Desenvolvimento de produtos biotecnológicos; Capacidade de metabolização de substratos particulares; Presença de enzimas específicas; Indicadores para a identificação de uma bactéria.

UM TESTE BIOQUÍMICO PODE DISTINGUIR GÊNEROS E ESPÉCIES

Provas rápidas – seg. a min.

Testes de Metabolismo Catalase É uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (3%) em oxigênio e água; Indispensável na identificação de cocos Gram positivos; Estafilococos são catalase positivos; Estreptococos são catalase negativos; Exceto os estreptococos, a maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias decompõe o peróxido de hidrogênio

Prova da Catalase Controle positivo: Staphylococcus aureus Controle negativo: Streptococcus spp. O teste da catalase não tem qualquer aplicação na distinção do grupo Enterobacter pois todos são catalase (+)s.

Testes de Metabolismo Coagulase Presença desta enzima indica patogenicidade Na presença de plasma, os produtores de coagulase, como o Staphylococcus aureus, vão desencadear os mecanismos da coagulação Proteína de composição química desconhecida, com atividade semelhante a protrombina, capaz de transformar o fibrinogênio em fibrina (coágulo) Diferenciar espécies de Staphylococcus (S. aureus e S. epidermidis)

Coagulase - +

Testes de Metabolismo Oxidase Citocromo oxidase do tipo AA3 Tetrametil-p-fenilenodiamina (1% segundo Kovacs) Citocromo oxidase do tipo AA3 Diferenciar os gêneros Neisseria e Pseudomonas (oxidase positiva) de outros cocos Gram - ; Distinguir a família Enterobacteriaceae (oxidase negativa) de outros bacilos Gram negativos (oxidase positiva);

Prova da Oxidase Interpretação do Teste Azul (Púrpura): reação + Rosa: reação –

Provas lentas – 24 h ou mais

Testes de Metabolismo B A Enterobacteriaceae (Gram –) A- Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella fermentam lactose produzindo ácido e gás B- Shigella e Salmonella não utilizam lactose em seu metabolismo. Degradam a peptona formando amônia. Ágar MacConkey - contém bile que inibe o crescimento da maioria das bactérias Gram +, cristal violeta (inibe algumas bactérias Gram +) e vermelho neutro (indicador de pH), lactose e peptona. A B

Diferenciação de Salmonella e Shigella Testes de Metabolismo Diferenciação de Salmonella e Shigella Ágar XLD – Xilose, lisina e deoxicolato (ácido biliar). Meio seletivo usado para isolamento de Salmonella e Shigella a partir de amostras clínicas e alimentos. Contém phenol red como indicador de pH (ácido – amarelo; alcalino – rosa a vermelho). Salmonella metaboliza o tiosulfato produzindo H2S que reage com o ferro produzindo um composto escuro (centro da colônia negro).

Indol , Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato PROVAS IMViC Indol , Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato Esta série de quatro provas permite identificar um organismo do grupo coliforme.

IMViC - Enterobactérias Teste de Indol (reativo de Kovacs) Detecta a ação da enzima triptofanase, determinando a capacidade do microrganismo produzir Indol através da degradação do aminoácido L-triptofano. Após a incubação, adiciona-se o reativo de Kovacs (p-dimetil aminobenzaldeído). O indol se complexa ao reativo de Kovacs produzindo um anel rosa. Reação positiva Reação Negativa

IMViC - Enterobactérias Teste de MR – Vermelho de metila - O Vermelho de Metila é o indicador de pH; - O teste é utilizado na verificação da produção de grandes quantidades de ácidos, como o ácido pirúvico no metabolismo da glicose; - As enterobactérias usam o ácido pirúvico para produzir outros ácidos como ác.lático, ác.acético e ác.fórmico. Reação negativa Reação positiva pH >6,2 – Amarelo (negativo) pH< 4,4 – Vermelho (positivo)

IMViC - Enterobactérias Teste de Voges-Proskauer (produção de acetoína) Verifica a capacidade do microrganismo em produzir ácidos como o Acetilmetilcarbinol (acetoína) como um precursor da síntese de 2,3 butanediol. Adiciona-se NaOH que reage com a acetoína produzindo um composto vermelho. Reação negativa Reação positiva

IMViC - Enterobactérias Teste de Citrato de Simmons Diferencia os microrganismos pela capacidade de usarem o Citrato como única fonte de carbono. Azul de bromotimol como indicador de pH Para que a bactéria possa utilizar o citrato é necessário que ela tenha a Citrato permease, que vai permitir a entrada desse composto no interior da célula; Uma vez incorporado, o citrato será degradado pela enzima Citrase, produzindo compostos alcalinos.

Enterobactérias Alguns testes bioquímicos para Enterobactérias

Bioquimismo - Salmonella spp. Plaqueamento seletivo diferencial: Proteose peptona; Extrato de levedura; Lactose; Sacarose; Salicina; Sais biliares; Cloreto de sódio; Tiossulfato de sódio; Citrato ferrico amoniacal; Fucsina ácida; HE (Hectoen enteric): 24h Colônia verde com centro negro Seletivos H2S Obs: Não vai para a autoclave!

Bioquimismo - Salmonella spp. Teste da Uréia: Uréia alcalina:

Bioquimismo - Salmonella spp. Teste TSI: • Lactose (1%) ; • Sacarose (1%); • Glicose (01%); • Vermelho de fenol; • Tiossulfato de sódio; • Sulfato ferroso; Cloreto de sódio; Extrato de carne; Extrato de levedura; Peptona TSI (Triple sugar iron): Carboidratos Indicador de pH 24h ou Indicador de H2S Nutrientes

Chave dicotômica