Prof.Doutor José Cabeda Estudo do complemento Prof.Doutor José Cabeda

O sistema do complemento Prof. Doutor José Cabeda

Testes funcionais do complemento (I) CH50 Baseada na lise pelo complemento de eritrócitos de carneiro sensibilizados com anticorpo de coelho anti-eritrócitos de carneiro Diluições seriadas de soro teste são misturados com igual volume dos eritrócitos sensibilizados e incubados a 37ºC A reacção é parada com PBS frio A lise é estimada pela [hemoglobina] por espectrofotometria Comparação com 0% de lise (sem soro) e 100% lise (por acção de água pura). Actividade do complemento dada pela diluição necessária para obter 50% de lise. Resultado expresso pelo inverso desta diluição em unidades de CH50/mL soro. Resultado baixo pode significar deficiência ou consumo Heterozigotos têm habitualmente valores normais-baixos de CH50 Prof. Doutor José Cabeda

Testes funcionais do complemento (II) AH50 Semelhante ao CH50, por se basear na quantificação da lise de eritrócitos Baseia-se no facto de a via alterna ser activada por e provocar a lise de eritrócitos de coelho Activação da via clássica inibida por quelatação do Ca2+ com EGTA A maior parte das deficiências de C3 por consumo são devidas à activação da via alterna, devido ao ciclo de amplificação do C3 Prof. Doutor José Cabeda

Testes funcionais do complemento (III) Outros ELISA Detecção do componente terminal da cascata de activação clássica C5b-6-7-8-9 Medida de lise de liposomas contendo enzimas Utiliza processos automáticos de quimica clínica Prof. Doutor José Cabeda

Testes funcionais do complemento (IV) Testes funcionais para componentes do complemento Fazer CH50 ou AH50 com Complementação por soros deficientes num componente Complementação com componentes puros Prof. Doutor José Cabeda

Testes quantitativos do complemento Quantificação de proteínas do complemento Identificação das deficiências Quantificação de produtos de hidrólise do complemento Diferenciação entre deficiência e consumo C4a/C4 ou C4d/C4=> via clássica Bb => via alterna C3a e C5a => via final (mas têm curtas semi-vidas, pelo que a Protein S é uma melhor alternativa) Nefelometria Prof. Doutor José Cabeda

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Prof. Doutor José Cabeda Colheitas Má colheita => deficiência de complemento Evitar >2 ciclos de congelação/descongelação Soro com crioglobulinas tem que ser testado de imediato Utilizar tubo sem anticoagulante, deixar coagular (30 min a 37ºC ou 60 a RT), centrifugar e guardar a –70ºC Tempo excessivo de espera origina deficiência (as proteases celulares degradam as proteínas do complemento) Crioglobulinas, complexos imunes, bactérias e particulas activam o complemento in vitro provocando falsa deficiência Hemólise interfere na leitura Prof. Doutor José Cabeda

Prof.Doutor José Cabeda Análise Genética do C4 Prof.Doutor José Cabeda

O Gene do C4 localiza-se no MHC-III Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda O gene do C4 dois genes: C4A (ácido) C4B (básico) 6p21.3 41 exões intrão 9 tem 7 Kb Se intrão 7 presente o gene tem 21 Kb Se intrão 7 ausente o gene tem 16 Kb. Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Os Módulos RCCX Módulo RCCX RP1 C4 CYP21 Tenascin X Normalmente 2 módulos em tandem RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Os alelos C4A e C4B C4B o aminoácido nucleofílico (His) ataca o grupo tiol de um resíduo de cisteína, formando um intermediário acídico C4A a asparagina, não sendo nucleofílica não origina a formação do intermediário pelo que a reacção de ligação ás outras moléculas é mais lenta Prof. Doutor José Cabeda

TaqI - RFLP (quantificação dos elementos RCCX) Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Taq I e pshA I RFLP Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Imunofixação de C4A e C4B Prof. Doutor José Cabeda

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Determinação de fenótipo C4 Prof. Doutor José Cabeda

PFGE para genotipagem C4 M S => 75Kb; L => 85Kb B LS => 105Kb; LL => 115 Kb T LSS => 135 Kb LLS => 140 Kb LLL => 150 Kb Prof. Doutor José Cabeda

RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB Número de módulos RCCX RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB Prof. Doutor José Cabeda