PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real) Quantificação de RNA PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real)
Métodos de Detecção de RNA Northern Blots Hibridização in situ Teste de Proteção de RNAse RT-PCR (qPCR) Microarranjo
qPCR Rapidez Sensibilidade Especificidade
Confirmação do produto específico PCR PCR Caixa Preta Eletroforese Confirmação do produto específico
PCR em tempo Real
Amplificação Visualização da amplificação em tempo Real PCR Tempo Real Amplificação Visualização da amplificação em tempo Real Curva de Melting
Etapas RNA RT PCR Quantificação Iniciadores Iniciadores e/ou sondas Modelos matemáticos
Fases da PCR Desnaturação inicial (95oC – 5’) Desnaturação (95oC – 15’’ a 1’) Anelamento (50 a 65oC – 1’) Extensão (72oC – 1’) Extensão final (72oC – 10’) Resfriamento (4-10oC - ∞) 30-40 x
Equipamentos ABI Prism 7700 iCycler iQ (BioRad) RotorGene 3000 (Corbett) LightCycler (Roche)
Detecção do sinal Fluoróforos Associados a sondas Intercalados ao produto amplificado
Beacons
TaqMan
Scorpion
Syber Green I
Desenho do Fragmento Menor que 100 pb Menor fragmento 67 pb Amplificam com maior eficiência Denaturam com maior facilidade Eficiência da Taq ( 30 -70 pb/sec) Menor fragmento 67 pb
Desenho dos Iniciadores Separando Exons Programas Tamanho 15- 20 pb 5 GC entre 20-70% Tm 58-60oC
Quantificação Absoluta Relativa Número de cópias por amostras Curva padrão Relativa Amostra A tem mais copias que B Normalização (Gene Referência)
Quantificação - Conceitos Visualização da amplificação em tempo Real Threshold Ct
Quantificação - Absoluta Curva Padrão
Quantificação - Relativa Modelos Matemáticos Tratamento Controle. Gene Alvo Gene Alvo Gene Ref Gene Ref DELTA DELTA
Quantificação - Relativa Gene Alvo Gene Referência Controle Controle Tratamento tratamento Pfaffl (2001)
Armadilhas Qualidade do RNA Especificidade x Inespecificidade da sonda Linearidade da RT Analise do dados O threshold
Conclusões Rapidez Sensibilidade Especificidade Limitado pelo alto custo dos reagentes e equipamentos