PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real)

Slides:



Advertisements
Apresentações semelhantes
João Luiz Fernandes e Aura Conci Universidade Federal Fluminense
Advertisements

Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA
CINEMÁTICA MOVIMENTOS.
Amplificação (clonagem) dos genes e seu armazenamento
SEQUENCIAMENTO DE DNA.
SNPs e suas aplicações Karine Begnini Doutoranda em Biotecnologia
BIBLIOTECAS DE DNA ou BANCOS DE DNA FABIANA SEIXAS
PCR Polymerase Chain Reaction
Genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos
Fonte das informações:
OPTICON Continuous Fluorescence Detection System
Técnicas de Eletroforese
Características do DNA
Universidade de São Paulo Centro de Energia Nuclear na Agricultura
Agentes infecciosos e as respectivas técnicas de análise molecular qualitativa e quantitativa A aplicação dos métodos de biologia molecular p/ a identificação.
Técnicas Moleculares para detecção de patógenos ambientais
MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA
Real-Time PCR.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reação de Polimerização em Cadeia - PCR
Reação de Polimerização em Cadeia - PCR
Prof. Odir A. Dellagostin
Desenho Técnico e CAD – Prof. Dennis Coelho Cruz – INTRODUÇÃO AO C.A.D. AULA 1.
Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)
Ajuste de curvas - Método dos Mínimos Quadrados
Genética Geral II Prof. Dr. Ricardo Lehtonen R. de Souza
Desenho de primer e otimizações de PCR Éderson Kido
Título do trabalho Arial Negrito corpo 72pt podendo ser reduzido para até corpo 60, caso a quantidade de texto ultrapasse o espaço delimitado Introdução.
Southern, Northern e Western Blot
Métodos de Análise de Expressão Gênica
Genômica funcional e metagenômica
ANÁLISE INSTRUMENTAL.
TRANSFERÊNCIA DO PÓ PARA NOVO TUBO MATERIAL VEGETAL MACERAR
PCR Genética Molecular.
Ciências Farmacêuticas 2º ano Métodos Instrumentais de Análise I
Engenharia Ambiental – UNISUL Profa. Denise Esteves Moritz
O Mercado Brasileiro de Gestão do Conhecimento
Real Time PCR.
Título fonte Arial tamanho 60 Autores fonte Arial tamanho 40 Endereços fonte arial tamanho 36 Endereços fonte arial tamanho 36 Texto fonte arial tamanho.
BIOTECNOLOGIA Sérgio Vasconcelos.
Título do trabalho Arial Negrito corpo 72pt podendo ser reduzido para até corpo 60, caso a quantidade de texto ultrapasse o espaço delimitado Nomes dos.
CUSTOS DE PRODUÇÃO.
Estudos de Estabilidade
Wendt, S. N. ; Mazza, M. C. ; Quoirin, M. G. ; Sousa, V. A
INTRODUÇÃO Corpo do texto Arial regular tamanho 32pt, podendo ser reduzido para até 24pt, caso a quantidade de texto ultrapasse o espaço delimitado. Corpo.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
2ª Reunião do Grupo Técnico de Métodos Analíticos e Amostragem do Codex Alimentarius no Brasil (Fiocruz- RJ)
ÁCIDOS NUCLÉICOS São polímeros de nucleotídeos, sendo estes formados por uma base nitrogenada, um grupamento fosfato e uma pentose( açúcar de 5 carbonos).
Graziele Fonseca de Sousa
Hibridização in situ Yvana Cristina Jorge
Marcílio C. P. de Souto DIMAp/UFRN
PCR em Tempo Real Isabela Fonseca 13/04/2010.
PCR em Tempo Real RT- PCR em Tempo Real PCR quantitativo.
Tecnologia do DNA recombinante I:
GeneXpert MTB/RIF.
Obtendo as sequências moleculares: Amplificação e sequenciamento
Genética 2001/2002Prof.Doutor José Cabeda A Genética Molecular em Análises Clínicas.
Reação em cadeia da Polimerase
Alvaro Moreno Junior Karina Hoshino Simone Mariko Siguematu.
Curva padrão Sucessão crescente ou decrescente de pontos obtidos da relação entre A concentração da espécie padrão pela sua intensidade de sinal proveniente.
Mestrando: Cairé Barreto Vieira
Avaliação da diversidade microbiana
RT-PCR em Tempo Real Especificidade Sensibilidade Reproductibilidade
PCR e RT-PCR em Tempo Real
Polymerase Chain Reaction
PCR PCR – polymerase chain reaction Reação em cadeia da polimerase
Reação em cadeia da polimerase
PCR Polymerase Chain Reaction
QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA AMPLIFICAÇÃO.
Transcrição da apresentação:

PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real) Quantificação de RNA PCR quantitativo (RT-PCR Tempo Real)

Métodos de Detecção de RNA Northern Blots Hibridização in situ Teste de Proteção de RNAse RT-PCR (qPCR) Microarranjo

qPCR Rapidez Sensibilidade Especificidade

Confirmação do produto específico PCR PCR Caixa Preta Eletroforese Confirmação do produto específico

PCR em tempo Real

Amplificação Visualização da amplificação em tempo Real PCR Tempo Real Amplificação Visualização da amplificação em tempo Real Curva de Melting

Etapas RNA RT PCR Quantificação Iniciadores Iniciadores e/ou sondas Modelos matemáticos

Fases da PCR Desnaturação inicial (95oC – 5’) Desnaturação (95oC – 15’’ a 1’) Anelamento (50 a 65oC – 1’) Extensão (72oC – 1’) Extensão final (72oC – 10’) Resfriamento (4-10oC - ∞) 30-40 x

Equipamentos ABI Prism 7700 iCycler iQ (BioRad) RotorGene 3000 (Corbett) LightCycler (Roche)

Detecção do sinal Fluoróforos Associados a sondas Intercalados ao produto amplificado

Beacons

TaqMan

Scorpion

Syber Green I

Desenho do Fragmento Menor que 100 pb Menor fragmento 67 pb Amplificam com maior eficiência Denaturam com maior facilidade Eficiência da Taq ( 30 -70 pb/sec) Menor fragmento 67 pb

Desenho dos Iniciadores Separando Exons Programas Tamanho 15- 20 pb 5 GC entre 20-70% Tm 58-60oC

Quantificação Absoluta Relativa Número de cópias por amostras Curva padrão Relativa Amostra A tem mais copias que B Normalização (Gene Referência)

Quantificação - Conceitos Visualização da amplificação em tempo Real Threshold Ct

Quantificação - Absoluta Curva Padrão

Quantificação - Relativa Modelos Matemáticos Tratamento Controle. Gene Alvo Gene Alvo Gene Ref Gene Ref DELTA DELTA

Quantificação - Relativa Gene Alvo Gene Referência Controle Controle Tratamento tratamento Pfaffl (2001)

Armadilhas Qualidade do RNA Especificidade x Inespecificidade da sonda Linearidade da RT Analise do dados O threshold

Conclusões Rapidez Sensibilidade Especificidade Limitado pelo alto custo dos reagentes e equipamentos