Agentes infecciosos e as respectivas técnicas de análise molecular qualitativa e quantitativa A aplicação dos métodos de biologia molecular p/ a identificação e caracterização de agentes infecciosos tem apresentado rápida evolução nos últimos anos ,devido, em grande parte, ao desenvolvimento de novas tecnologias de análise do DNA e do RNA e à maior disponibilidade do testes diagnósticos em laboratórios clínicos e epidemiológicos Com os métodos atualmente em uso, é possível identificar e quantificar bactérias,vírus, fungos,protozoários em um prazo de poucas horasgarantindo sensibilidade e especificidade elevada. maranhao@ensp.fiocruz.br emaranhao@hotmail.com E. Maranhão Grupo do PAI/PNI na Ensp/Fiocruz Material elaborado p/ o curso de especialização em investigação epidemiológica de campo- Dpto de epidemiologia e métodos quantitativos em saúde- Ensp/Fiocruz-2009 Fundação JPM

Técnicas de análise molecular qualitativa[1] e agentes infecciosos Microorganismos métodos* materiais biológicos Papilomavírus humano Captura híbrida Raspado da lesão suspeita, hibridização em situ raspado de colo de útero, biópsia HIV-1 PCR,NASBA,TMA sangue Vírus da hepatite B(HBV) PCR,PCR em tempo real sangue Vírus da hepatite C(HCV) RT-PCR,TMA,PCR em tempo real sangue Chlamydia trachomatis PCR,LCR,captura híbrida,TMA Raspado de colo de útero, urina, raspado ureteral Neisseria gonorrhoeae PCR,LCR,captura híbrida Raspado de colo de útero, urina,raspado ureteral ESPM

Técnicas de análise molecular qualitativa[2] Microorganismos métodos* materiais biológicos Toxoplasma gondii PCR, PCR em tempo real sangue,liquido amniótico Micobactérias PCR, PCR em tempo real escarro, lavados, urina TMA biópsia Citomegalovírus PCR,NASBA,PCR em tempo real sangue,urina,liquor Herpes simples tipos 1 e 2 PCR,PCR em tempo real sangue , liquor Vírus Epstein –Barr PCR,PCR em tempo real sangue Parvovírus B 19 PCR,hibridização sangue Eritrovírus B 19 PCR sangue, liquido amniótico ESPM

Técnicas de análise molecular qualitativa[3] Microrganismo métodos* materiais biológicos HTLV-1 e HTLV-2 RT-PCR sangue,liquor, biópsia Vírus da dengue PCR,PCR em tempo real sangue Vírus da rubéola RT-PCR sangue Herpesvírus-8 PCR sangue Herpes vírus-6 PCR sangue, liquor Vírus JC PCR liquor Enterovírus PCR liquor,sangue Vírus da caxumba RT-PCR liquor ESPM

Métodos * Obs::Estas não são as única técnicas disponíveis, mas as + comumente empregadas p/ investigação de cada um dos microorganismos ::  PCR [polymerase chain reaction] ;  RT-PCR [reverse-transcribed polymerase chain reaction] ;  NASBA [nucleic acid sequence-based amplification] ; LCR [ligase chain reaction] ; TMA [transcription mediated amplificacion] . OBS:A metodologia do PCR e suas variantes(RT-PCR,PCR em tempo real) são as + amplamente utilizadas como método de detecção qualitativa ESPM

Técnicas de análise molecular quantitativa[1] Agentes infecciosos Vírus métodos* materiais biológicos HIV-1 RT-PCR,b-DNA,NASBA sangue Vírus da hepatite B (HBV) PCR,b-DNA,PCR em tempo real sangue Vírus da hepatite C (HCV) RT-PCR,b-DNA,PCR em tempo real sangue Citomegalovírus PCR,NASBA,PCR em tempo real sangue, urina, liquor Vírus Epstein-Barr PCR,PCR em tempo real sangue,liquor Obs:: PCR [polymerase chain reaction] ; RT-PCR [reverse-trancribed polylerase chain reaction] ; B-DNA [branched-DNA] NASBA [nucleic acid sequence-based amplification] . ESPM

Glossário[1]  Polymerase Chain Reaction O método PCR consiste na amplificação de um segmento específico do DNA com a utilização de 2 oligonicleotídeos ( iniciadores ou primers) e da enzima DNA polimerase. RT-PCRé um método de amplificação realizado a partir de moléculas de RNA.Após a extração do RNA,sintetiza-se cDNA (DNA complementar) empregando-se a enzima transcriptase reversa de origem viral. A partir do cDNA, emprega-se o método de PCR para amplificação. PCR em Tempo RealO método do PCR em tempo real emprega os mesmos princípios do PCR convencional, mas com acompanhamento contínuo da reação, permitindo a quantificação precisa do material amplificado a cada ciclo de amplificação por meio da detecção de luz emitida por corantes fluorescentes. ** Obs:Atualmente o método do PCR em tempo real é considerado um dos métodos de escolha p/ testes moleculares quantitativos e qualitativos em decorrência de suas vantagens sobre o PCR convencional:: + or rapidez de execução; +ores sensibilidade e reprodutibilidade; - or risco de contaminação de amostras no ambiente laboratorial,devido a ausência de manipulação das amostras após o processo de amplificação.

Glossário[2] TMA e NASBAsão métodos de amplificação isotérmica. Branched-DNAApós a extração do RNA, um conjunto de sondas é empregado p/ captura das moléculas de RNA em uma microplaca. Outros 2 conjuntos de sondas ligam-se então ao RNA capturado , e um substrato é adicionado p/ o complexo enzimático associado à sonda. A leitura dos resultados é feita por quimioluminescencia. Captura hibrida  é um método que tem sido utilizado largamente na detecção e subtipagem do papilomavírus humano.É um método de identificação direta do DNA.Como inúmeras moléculas do anticorpo conjugado se ligam a cada híbrido capturado, ocorre um “amplificação” do sinal, o que determina boa sensibilidade do método. Sequenciamento do DNA é um método que permite definir a seqüência de bases de um segmento específico do DNA.Atualmente, é realizado por meio de equipamentos -sequenciadores de DNA-, que permitem a análise automatizada de grande número de segmentos em poucas horas. ESPM

Referência Burke W. Genetic Testing.New England Journal of Medicine 2002;347:1867-1875. Mauro S. Figueiredo.Fundamentos de Biologia Molecular e sua importância clínica. Connor J M, Fergunson-Smith M A . Essential Medical Genetics,#rd edition.Blackwell Scientific Publicatios,1991.