Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Departamento de Farmacologia Estudo de Bioequivalência de duas formulações de pantoprazol em voluntários sadios de ambos os sexos Aluna: Maria Carla Petrellis Orientador: Prof. Dr. Gilberto De Nucci 2004

Bioequivalência - Considerações Adoção de uma política de medicamentos genéricos Produção Garantia de Qualidade Prescrição Dispensação e uso É parte fundamental das diretrizes para promoção do uso racional de medicamentos em nosso País

Medicamento Genérico: na concepção da OMS, “ produto farmacêutico intercambiável” deve apresentar a mesma segurança e eficácia do medicamento de referência produzido após a expiração da proteção patentá- ria ou outros direitos de exclusividade pela DCI (Denominação Comun Internacional), ou seja não apresenta marca

Medicamentos Bioequivalentes (F.D.A): São equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas que , ao serem administrados: na mesma dose molar, a mesma indicação terapêutica nas mesmas condições experimentais, (mesma via de administração) Não apresentam diferenças estatísticas significantes quanto: à velocidade de absorção à extensão de absorção

Parâmetros para determinar a Bioequivalência ASC (0-t) = Área sob a curva de concentração sangüínea vs tempo Cmax = Pico de concentração plasmática do fármaco t(max) = Tempo para atingir o pico da concentração máxima

Validação de Métodos Bioanalíticos A etapa crítica no Estudo de Bioequivalência é o desenvolvimento e validação de ensaios bioanalíticos Consiste na realização de experimentos Encontrar condições necessárias para a quantificação do analito em questão

Metodologias Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE, LC-MS/MS) Cromatografia Gasosa (CG, CG-MS/MS) Métodos Imunológicos (RIA, EMIT e ELISA)

Parâmetros da Validação Bioanalítica Especificidade - Seletividade Especificidade: o método produz uma única resposta analítica para um único analito Seletividade: a habilidade de uma técnica analítica em distinguir e quantificar, ou não, uma droga em relação a outras resposta de diferentes componentes presentes nos fluidos biológicos

Linearidade* Habilidade de se obter resultados diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra Fatores na avaliação de curva de calibração: Precisão e exatidão menor ou igual a 15% nas determinações nominais da curva de calibração Precisão e exatidão menor ou igual a 20% nas determinações nominais do LOQ *International Conference of Harmonization - ICH, Guideline for Validation of Analytical Procedure Methodology, 1996; Comissionof European Communities – Comittee for Proprietary Medicinal Products 111/5626/94 final draft, 1994; Buick et al., 1990.

quatro das seis concentrações nominais devem estar de acordo com critérios acima mencionados, incluindo os pontos do LOQ e os pontos de calibração de menor concentração. Valor de coeficiente de correlação linear ou igual ou maior que 0.95

Precisão Grau de concordância entre os resultados de análises individuais, quando o procedimento analítico é aplicado em diversas vezes em uma mesma amostra analítica, em idênticas condições experimentais. Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Causon, R. 1997; Brittain, 1998; Relatório final da ISO (International Organization for Standardization), 1990/1991; Hartmann et al., 1994; Shan et al., 1992; Buick et al.,1990; USPXX 1990; Brooks, 1985 Buick et al., 1990

Repetibilidade (Precisão intra-ensaio): Habilida-dade de repetições da metodologia empregada nas mesmas condições laboratoriais, considerando um único dia de análise Reprodutibilidade (Precisão inter-ensaio): Habilidade de repetições da mesma metodologia aplicada sob diferentes condições laboratoriais, em subseqüentes ocasiões que podem variar semanas ou até meses

Exatidão É definida como o grau de concordância entre os valores individuais encontrados em relação aos valores reais ou nominais Um único dia “ Exatidão Intra-ensaio” Dias diferentes “Exatidão Inter-ensaio” * Causon, R. 1997; Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Brittain,1998 e Mehta, 1989.

Limite de Quantificação (LQ) Representa a mais baixa concentração de um composto de investigação que atende os re- quisitos para precisão e exatidão do ensaio ana- lítico

Deve ser considerada durante a fase do desenvolvimento analítico Recuperação A recuperação avalia a eficiência da extração e sua variabilidade. Embora recuperações próximas de 100% sejam desejáveis, baixas recuperações po- dem ser utilizadas (50-60%) se forem precisas, exa- tas e reprodutíveis. Estabilidade Deve ser considerada durante a fase do desenvolvimento analítico

Critérios de Aceitabilidade Precisão: Os CV% do inter-day para os QCs é  15%, e  20% para o LOQ QC, avaliados em um mínimo de 3 lotes. Exatidão: A média dos valores do inter-day devem ser menores que 15% do valor nominal dos QCs, e não desviar mais que 20% para LOQ QC. Sensibilidade: O menor ponto da curva de calibração aceitável como limite de quantificação (LOQ) do método é aquele com CV%  20% (inter-day).

Pantoprazol Farmacocinética Administração por via oral e endovenosa POTENTE INIBIDOR DE LONGA DURAÇÃO DA BOMBA ÁCIDA DA SUPERFÍCIE DAS CÉLULAS PARIETAIS GÁSTRICAS Farmacocinética Administração por via oral e endovenosa Ampla biodisponibilidade em média 80% Linear até a dose de 80 mg Alta ligação com as proteínas plasmáticas (98%) Baixo volume de distribuição Curta meia vida de eliminação ± 2hs Metabolismo hepático via citocromo P450 Principal via de eliminação é renal (80%)

Farmacodinâmica Ativação em meio de extrema acidez É convertido rapidamente na forma ativa, a sulfonamida cíclica Ligação covalente com os grupos cisteínicos da bomba H+/ K+ - ATPase presente nas superfícies caniculares das células parietais Inibição total da função da bomba ácida Bloqueio da etapa final da produção do ácido gástrico

Objetivos

Avaliar a bioequivalência de duas formulações de pantoprazol baseada na comparação dos valores obtidos dos parâmetros farmacocinéticos de cada formulação calculados a partir de medida das concentrações plasmáticas de pantoprazol Validar a metodologia analítica por LC-MS/MS empregada na quantificação das concentrações de pantoprazol em amostras de plasma humano

Protocolo do Estudo

Seleção dos Voluntários Vinte e dois voluntários sadios de ambos os sexos Idade entre 18 e 45 anos (média= 30 ± 1 ano) Peso Corporal entre 55 e 100 kg (média 77,5 ± 10,1 kg) Entrevista e exames clínicos pré-estudo Assinatura do Termo de Consentimento Livre Esclarecido do estudo Protocolo Clínico Aprovado pela Comissão de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Federal do Ceará

Protocolo Clínico Delineamento aleatório cruzado, aberto de dois períodos, com intervalos de 15 dias entre as doses de pantoprazol Hospitalização por 24 horas na Unidade de Farmacologia Clínica Internação seguida de dieta padrão até 23:00 hs Jejum após 23:00hs, e início do estudo clínico às 7:00hs, dose única por via oral de 40 mg de pantoprazol Dieta padrão às 12:00 e às 18:00 hs Restrições: alimentos contendo xantinas

Coleta das amostras Amostras de sangue foram coletadas através de escalpe em veia superficial do antebraço do voluntário Os intervalos de coleta: antes (zero), 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 5.0, 6.0, 8.0 e 12.0 horas As amostras foram centrifugadas durante 10 minutos a 4000rpm Obtenção do soro e armazenamento na temperatura de - 20°C

Protocolo Analítico Princípio do Método: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de fase-reversa , acoplada a espectrometria de massa (LCMS/MS) Extração Líquido-Líquido com emprego de dietileter:diclorometano (70:30v/v) como solvente extrator

PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÕES Pantoprazol Solução estoque de Pantoprazol (1.0 mg/mL) em metanol:água (50:50) Concentração final de 10 g/mL Carbamazepina (P.I) Solução estoque de carbamazepina (1.0 mg/mL) em metanol:água (50:50) concentrações finais de 100 g/mL e 1 g/mL

PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E AMOSTRAS DE CONTROLE DE QUALIDADE (C PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E AMOSTRAS DE CONTROLE DE QUALIDADE (C.Q) Curva de calibração contaminação de plasma humano controle emprego da solução padrão de pantoprazol (10 g/mL) obtenção dos seguintes pontos da curva de calibração: Branco, Branco + PI, 35, 50, 70, 100, 200, 500 e 1000 ng/mL

Controle de qualidade: contaminação de plasma humano controle emprego da solução padrão de pantoprazol (10 g mL) obtenção dos seguintes níveis de concentração: CQA – 120 ng/mL CQB – 800 ng/mL CQC – 600 ng/mL (fator de diluição 1:5) temperatura de armazenamento - 20 °C

EXTRAÇÃO DE AMOSTRAS 0.5 mL de amostras de plasma: voluntários, pontos de da curva de calibração, controle de qualidade em tubos de ensaio 0.05 mL de carbamazepina (1 g/mL) breve agitação, repouso por 5 minutos 4 mL de dietileter-diclorometano (70:30), em seguida vigorosa agitação por 30 segundos, seguido centrifugação

obtenção da fase orgânica e transferência para tubos de ensaio revestidos de silicone evaporação em banho- maria (37°C) sob fluxo constante de nitrogênio reconstituição das amostras analíticas com 200 L de fase móvel, em seguida breve agitação acondicionamento das amostras analíticas em vials do injetor automático para posterior análise

CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS E ESPECTROMETRIA DE MASSA Sistema de Cromatografia: Cromatografia Líquida Alta Eficiência de fase - reversa Bomba binária Coluna Cromatográfica: Coluna analítica de fase-reversa :Genesis 4  m C8; 150x4.6 mm diâmetro interno na temperatura de 40 °C Fase Móvel: 80% Acetonitrila – 0.1% ácido trifluoroacé- tico(TFA) – 20% Água Deionizada Fluxo constante: 0.9 mL/min por gradiente isocrático

Eluente: 100  L/min analisado no detector MS/MS Injetor Automático: alíquotas de 40  L/min na tempera-tura 10 °C Tempo de Eluição: 4 minutos Tempo de Retenção: Pantoprazol (1.86 min) e Carbama- zepina (2.2 min) Detector: O Espectrômetro de massa do tipo Quatro II equipado com “ atmospheric pressure ionization (API) electrspray” , operando de modo positivo (MS+) Pantoprazol : 366.1 > 91.50 , 50V e 35 eV Carbamazepina: 236.9 > 194.2 , 25V e 15 eV

Resultados

Validação Analítica

Figura 1 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Branco (MRM of two channels; ES+ 366.10  91.50)

Figura 2 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Lipêmico (MRM of two channels; ES+ 366.10  91.50)

Figura 3 – Cromatogramas de íons (MRM): Plasma Hemolisado (MRM of two channels; ES+ 366.10  91.50)

a b Figura 4 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Limite de Quantificação pantoprazol (35ng/mL), (MRM of two channels; ES+ 366.10  91.50). (B) Padrão interno carbamazepina (50ng/mL), (MRM of two channels; ES+ 236.89  194.09)

a b c Figura 5 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Amostra de um voluntário coletada 5 horas após administração da formulação teste (40 mg de panto- prazol), (MRM: 366.10  91.50). (B) Plasma contaminado com o padrão interno carbamazepina (50 ng/mL), (MRM: 236.89  194.09).(C)Concentração plasmática máxima (99 ng/mL), pantoprazol), (MRM: 366.10  91.50) e seu padrão interno, carbamazepina (50ng/mL), (MRM: 236.89  194.09)

a b c Figura 6 – Cromatogramas de íons (MRM): (A) Amostra de um voluntário coletada 3 horas após administração da formulação padrão (40mg de panto- prazol), (MRM: 366.10  91.50). (B) Plasma contaminado com o padrão interno carbamazepina (50ng/mL), (MRM: 236.89  194.09).(C)Concentração plasmática máxima (145 ng/mL), pantoprazol), (MRM: 366.10  91.50) e seu padrão interno, carbamazepina (50ng/mL), (MRM: 236.89  194.09)

a b Figura 7 – Espectro de massa: (A) Espectro do pantoprazol adquirido em Q1, energia do cone = 50v. (B) Espectro dos produtos de íons do panto- prazol adquirido em Q2 após colisão induzido dissociação, energia do cone = 50v e energia de colisão 35eV

a b Figura 8 - Espectro de massa da carbamazepina: (A) Q1= 25v (B) Q2 = 25v / 15eV

Figura 9 – Curva de calibração obtida após a contaminação de plasma humano com pantoprazol (35 – 1000 ng/mL) e carbamazepina (50 ng/mL)

Tabela 1- Validação da Curva de Calibração

Tabela 2- Validação dos Controles de Qualidade *Controle de Qualidade 3000ng/mL foi diluído na proporção de 1:5 para quantificação

Parâmetros Farmacocinéticos

Figura 10- Concentrações plasmáticas (médias aritméticas  EP) de pantoprazol em função do tempo para as duas formulações de pantoprazol (40mg) administradas em 22 voluntários sadios de ambos os sexos.

Tabela 3 – Parâmetros farmacocinéticos de pantoprazol obtidos após a administração de cada uma das formulações de pantoprazol (40mg) nos 22 voluntários.

Tabela 4 – Análise estatística das razões individuais teste/referência da ASC 0-12h, ASC0-, Cmax, e das diferenças teste – referência de Tmax entre ambas as formulações de pantoprazol bMédia Aritmética das diferenças individuais c90% das diferenças individuais

Conclusão

Os valores para a precisão e exatidão do inter ensaio da linearidade estão dentro dos critérios de aceitabilidade para validação analítica Os valores para a precisão e exatidão do inter ensaio dos controles de qualidade estão dentro dos critérios de aceitabilidade para validação analítica. Concluímos que a metodologia empregada apresentou valores aceitáveis para a validação dentro das exigên- cias presentes nos guias dos Órgãos Oficiais de Saúde

Os valores das médias das razões individuais de ASC (0-12), ASC (0-) e Cmáx estão totalmente incluídos dentro da faixa de bioequivalência (80-125%) As diferenças individuais te tmáx são estatisticamente diferentes de zero como mostrado pelos intervalos de confiança de 90% Os valores das médias das razões individuais da relação de Cmáx / ASC (0-12) estão totalmente incluídos dentro da faixa de bioequivalência (80-125%) Concluímos que a formulação teste Pantoprazol é bioequi- valente à formulação referência Pantozol tanto quanto para velocidade quanto para extensão de absorção