Estudo da diversidade genética do HIV-1 e resistência primária a anti-retrovirais em pacientes soropositivos do Estado de Santa Catarina Coordenador: Prof. Dr. Aguinaldo R. Pinto Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia Centro de Ciências Biológicas Universidade Federal de Santa Catarina

Equipe: Dr. Carlos R. Zanetti – UFSC/SC Dr. Edmundo C. Grisard – UFSC/SC Dr. Luiz Gustavo Escada Ferreira – HRSJ/SC Dra. Mariza Morgado – Fiocruz/RJ Dr. Gonzalo Bello – Fiocruz/RJ Dr. Monique Lindenmeyer Guimarães – Fiocruz/RJ MSc. Tiago Gräf – UFSC/SC Artur Battisti – UFSC/SC

Objetivo Estudar a diversidade viral do HIV-1 circulante no Estado de Santa Catarina e estimar, de forma preliminar e descritiva, a freqüência e diversidade de mutações que conferem resistência primária a anti-retrovirais na população de indivíduos soropositivos desse Estado.

Distribuição dos subtipos do HIV-1

Epidemiologia molecular do HIV-1 no Brasil: Subtipo B: 70-90% das infecções Subtipo F1: 3-17% das infecções Recombinantes BF1: 2-14% das infecções Subtipo C: 0-3% das infecções (SA FILHO et al., 2005; GADELHA et al., 2003; CARDOSO et al., 2009; MACHADO et al., 2009) Regiões Norte, Nordeste, Sudeste e Centro-Oeste Região Sul: Grande prevalência de Subtipo C: 20 a 79% (SANTOS et al., 2007; LOCATELLI et al., 2008; RODRIGUES et al., 2010; TOLEDO et al., 2010)

TERAPIA ANTIRETROVIRAL Capaz de aumentar a sobrevida do paciente em muitos anos; Seis classes de medicamentos disponíveis: NRTI – Inibidores nucleosídicos da RT NNRTI – Inibidores não nucleosídicos da RT PI – Inibidores da protease INTI - Inibidores da integrase Inibidores de fusão Inibidores de entrada RESISTÊNCIA: Mutações Resistência primária em indivíduos virgens de tratamento

Brasil Ministério da Saúde brasileiro disponibiliza sem custos os medicamentos da terapia antiretroviral; Estudos demonstram taxas de resistência primária em torno de 7-8% (SPRINZ et al., 2009; INOCENCIO et al., 2009); Santa Catarina Apenas um estudo realizado em indivíduos virgens de tratamento de Itajaí e Camboriú (BRÍGIDO et. al., 2007): 8,3% dos indivíduos estudados possuíam pelo menos uma DRM;

Metodologia Blood samples from 82 HIV-positive patients followed up at public reference services from Florianópolis metropolitan area (Hospital Regional Dr. Homero de Miranda Gomes/São José), were collected from May 2008 to February 2009; PBMC were isolated and whole DNA were extracted; Nested-PCR amplification and sequencing of the HIV-1 env-gp120 and pol (protease/reverse transcriptase and integrase) regions; Alignment using ClustalX and phylogenetic inferences by neighbor joining (NJ) algorithm; Bootscaning analysis using Simplot program; Drug resistance profile was analyzed at the Stanford HIV Drug Resistance Database.

Região PR/RT – 82 amostras analisadas Subtipo B –13,5% Subtipo F1 – 1,2% Subtipo C – 74,5% Formas Recombinantes – 10,8% CRF31_BC – 3,6% URF_BC – 6% URF_BF – 1,2%

Resultados e Discussão Fig.1. Frequency of HIV-1 subtypes at the different genomic regions analyzed. HIV-1 subtypes were determined by phylogenetic and bootscaning analyses, as described in Methods.

Resultados e Discussão Table : Epidemiological data of HIV-1 infected individuals according to the virus subtype. Total (n=82) Subtype C (n=54) Subtype B (n=11) BC Mosaic (n=15) Mean age (years) 37.8 ± 10 39 ± 9.2 31.3 ± 9.3 37 ± 11 Sex (%) Male 40 (48.8%) 23 (43%) 9 (82%) 7 (46.7%) Female 42 (51.2%) 31 (57%) 2 (18%) 8 (53.3%) Mean Diagnostic year 2004 ± 3.8 2004 ± 4.3 2005 ± 2.1 2005 ± 2.7 Exposure Categories Heterossexual 58 (70.6%) 41 (76%) 3 (27.3%) 12 (80%) MSM 18 (22%) 9 (16.5%) 8 (72.7%) 1 (6.6%) Injection Drug User 4 (5%) 3 (5.5%) - Unknown 2 (2.4%) 1 (2%) Mean CD4 T-cell count 513 ± 312 492 ± 269 563 ± 429 522 ± 366 Mean Viral Load (log10) 4.1 ± 0.8 4.4 ± 0.9 3.9 ± 0.7 Associação altamente significativa (p<0,001) entre subtipo C e mosaico BC com a categoria de exposição heterossexual e subtipo B e categoria HSH

Distribuição dos subtipos e formas recombinantes do HIV-1 nas categorias de exposição Heterossexual, HSH e UDI. Apenas 5,2% dos Heterossexuais eram infectados pelo subtipo B; 50% dos indivíduos do grupo HSH eram infectados pelo subtipo C; Mais de 70% do grupo UDI era infectado pelo subtipo C. Subtipo B quase restrito a categoria HSH e subtipo C circulando em todas categorias de exposição.

Resultados e Discussão Phylogenetic analysis of CRF31_BC-like sequences: Neighbor-joining phylogenetic tree of PR/RT region (2316–3316 nt relative to HXB2), including only the CRF31_BC-like sequences from Santa Catarina (black diamonds) and subtype reference sequences. Reliability was tested with 1000 replicates bootstrapped, values considering significant (above 70%) are shown.

Distribuição dos subtipos do HIV-1 e formas recombinantes nos estados da região sul do Brasil (RT/protease) Maior prevalência de subtipo C em Santa Catarina; Baixa prevalência de CRF31_BC no estado de Santa Catarina; Grande prevalência de URF_BC em Florianópolis.

NNRTI resistance mutations Table 2: Primary drug resistance mutations associated to protease, reverse transcriptase and integrase genes among treatment naïve patients. Sample Pol Subtype PI resistance mutations NRTI NNRTI resistance mutations INTI Resistance Profile Low Intermediate High BR10SC06 C S147R + E138A RAL, ELV BR10SC07 N88D NFV BR10SC29 B K219Q AZT BR10SC42 M46I BR10SC46 V75M DDI d4T BR10SC47 K101E, V106M, G190A, M230L ETR DLV, EFV, NVP BR10SC50 M41L, T215C ABC, DDI, TDF AZT, d4T BR10SC107 M41L G190A AZT, d4T, ETR EFV NVP BR10SC131 K103N 9/82 PI: protease inhibitors; NRTI: nucleoside reverse transcriptase inhibitors; NNRTI: non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors; INTI: integrase inhibitors. ABC: abacavir; AZT: zidovudine; DDI: didanosine; DLV: delavirdine; d4T: stavudine; EFV: efavirenz; ETR: etravirine; NFV: nelfinavir; NVP: nevirapine, TDF: tenofovir; RAL: Raltegravir and ELV: elvitegravir.

Vigilância de transmissão de cepas resistentes a antiretrovirais Prevalência de DRM em pacientes da região metropolitana de Florianópolis é maior que na maioria das cidades brasileiras (11%); Média brasileira variando entre 7% e 8% (SPRINZ et al., 2009; INOCENCIO et al., 2009); Países desenvolvidos: 22,7% nos Estados Unidos (LITTLE et al., 2002) 14,2% na Inglaterra (CANE et al., 2005) Pequena prevalência de DRM para INTI introdução recente Vigilância de transmissão de cepas resistentes a antiretrovirais

Impactos do Projeto – Científico Grande prevalência de subtipo C em FLN/SC Baixa frequência de CRF31_BC Grande número de sequências mosaico BC Associação entre subtipo C e recombinantes BC com a categoria de exposição heterossexuais, assim como entre subtipo B e a categoria HSH Prevalência de DRM acima da média brasileira.

Impactos do Projeto – Econômico/Social/SUS As análises do presente estudo fornecem dados preliminares à comunidade médica e científica sobre a resistência primária contra drogas utilizadas no tratamento de indivíduos soropositivos no Estado de Santa Catarina. Estes resultados poderão determinar melhoras no tratamento anti-retroviral, utilizando-se assim, apenas formulações contra as quais o vírus não apresente resistência. A utilização da medicação correta desde o início da terapia anti-retroviral representará para o Estado uma redução nos gastos públicos com medicação e internação dos pacientes HIV positivos. Além disso, o uso de terapia anti-retroviral eficaz torna a carga viral do paciente baixa ou indetectável, isto faz com que paciente permaneça saudável por um maior período, reduzindo o aparecimento de doenças oportunistas causadas pela AIDS e conseqüentemente o número de internações em unidades de saúde pública, bem como diminuir a transmissão de cepas virais resistente a drogas.

Produção Científica Trabalhos apresentados em Congressos: Prevalence of protease and reverse transcriptase drug resistance mutations in drug naïve HIV1-positive individuals in metropolitan area of Florianópolis – XXI Encontro Nacional de Virologia, Gramado - RS, 2010. 2. Characterization of HIV-1 circulating in metropolitan area of Florianópolis confirms the high prevalence of subtype c and recombinants BC in Santa Catarina State - XXI Encontro Nacional de Virologia, Gramado-RS, 2010. 2010. 3. High prevalence of HIV-1 clade C in the metropolitan area of Florianópolis, Santa Catarina, Brazil – XX Encontro Nacional de Virologia, Brasília – DF, 2009. Produção Científica

Produção Científica Dissertação de Mestrado concluída:   Tiago Gräf. Epidemiologia molecular do HIV-1 e resistência primária a anti-retrovirais em indivíduos soropositivos da reigão metropolitana de Florianópolis/SC. 2010. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências/ UFSC. Orientador: Aguinaldo Roberto Pinto e Gonzalo Bello Tese de Doutorado em andamento: Tiago Gräf. Análise da dinâmica de transmissão e disseminação do HIV no Sul do Brasil: uma aplicação da epidemiologia molecular na saúde pública. Início: 2011. Tese de Doutorado em Biotecnologia e Biociências/UFSC. Orientador: Aguinaldo Roberto Pinto.

Produção científica Artigos científicos em revista internacional indexada Gräf & Pinto. The increasing prevalence of HIV-1 subtype C in Southern Brazil and its dispersion through the continent. Critical Reviews in Microbiology, submetido.

Desdobramentos Projeto: Análise da dinâmica de transmissão e disseminação do HIV no Sul do Brasil: uma aplicação da epidemiologia molecular na saúde pública. Objetivo: Caracterizar a dinâmica de transmissão do HIV-1 subtipo C em diferentes cidades da região sul do Brasil, destacando a história migratória deste subtipo e as mutações que conferem resistência a drogas. Equipe: UFSC, Hospital Regional de São José, Fiocruz/RJ, Centro de Desenvolvimento Técnico e Científico (CDCT) da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEEPS) da Secretaria da Saúde RS, Programas municipais de DST/Aids Joinville, Blumenal, Chapecó, Criciúma, Lages, Itajaí, Uruguaiana, Santa Maria, Rio Grande, Santa Cruz do Sul, Porto Alegre, Caxias do Sul e Cruz Alta. Casuística: 300. Aprovado pelo CEP.

OBRIGADO.