Fontes de Microrganismos Os microrganismos de Interesse Industrial pode ser obtidos: Isolamento de recursos naturais: (solo, água, plantas, etc); Compra em coleções de cultura: (Agricultural Research Service Culture Collection (EUA), Coleção de Cultura Tropical (Campinas); Obtenção de mutantes naturais; Obtenção de mutantes induzidas por métodos convencionais; Obtenção de microrganismos recombinantes.

Características Desejáveis do Microganismo Os microrganismos de Interesse Industrial devem: Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto; Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a ser elevada concentração do produto no caldo fermentado; Não produzir substâncias imcompatíveis com o produto; Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico; Não ser patogênico; Não exigir condições de processo muito complexas; Não exigir meios de cultura dispendiosos; Permitir rápida liberação do produto para o meio. 2 2

Características Desejáveis do Microganismo Exemplo da Fermentação Alcoólica: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 Fator estequiométrico teórico=0,511 Cada grama de glicose é convertida em 0,511g de etanol Saccharomyces cerevisiae, alcança 90% deste rendimento, enquanto outros microrganimos produzem etanol, mas com rendimentos muito inferiores; 3 3

Características Desejáveis do Microganismo Exemplo da Fermentação Alcoólica: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 Por outro lado, sabe-se que quando se atinge 8 à 10% em volume de álcool no meio, ocorre inibição da levedura e diminui a velocidade de conversão de açúcar em álcool. Portanto no caso de obtenção de álcool combustível, deve-se trabalhar com valores que não ultrapassem esta concentração alcoólica. Neste caso, a matéria prima incide em 60% do valor do custo do etanol. 4 4

Características Desejáveis do Microganismo Exemplo da produção de enzimas ou antibióticos: Açúcar + O2 Células + CO2 + Produtos + Intermediários Oxigênio, faz com que aumente consideravelmente a produção de células, enquanto pequena quantidade do produto é obtida. A matéria-prima é barata, mas a recuperação do produto é onerosa, chegando a 70% do valor do custo, porém o produto tem maior valor agregado. Portanto, buscar microrganismo, que cresçam menos, ou que acumulem menos intermediários, podem diminuir o custo do processo. 5 5

Características Desejáveis do Microganismo Exemplo da produção de glicoamilase por Aspergillus: Glicoamilase, enzima que hidrolisa amidos em glicose; Transglicosidase, enzima que polimeriza a glicose formando amido; Um microrganismo ideal, seria aquele que produz o mínimo de substâncias competitivas, ao mesmo tempo sintetize muito bem o produto pretendido. 6 6

Características Desejáveis do Meio de Cultivo Ser o mais barato possível; Atender as necessidades nutricionais do microrganismo; Auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser ligeiramente tamponado, o que evita variações drásticas de pH, ou evitar excessiva formação de espuma; Não provocar problemas na recuperação do produto; Os componentes devem permitir algum tempo de armazenamento, a fim de estarem disponíveis para o uso a qualquer tempo; Ter composição razoavelmente fixa; Não causar dificuldades no tratamento final do efluente. 7 7

Meio de Cultivo Os microrganismos utilizam: Fonte de carbono e energia, diversos açúcares, como glicose, sacarose, frutose, polissacarideos como amido e celulose; Fonte de nitrogênio: sais como (NH4+)2SO4, (NH4)2HPO4, aminoácidos e uréia; Fonte de fósforo: Monoamônio fosfato ou Diamônio fosfato; Outros elementos: Na, K, Ca, Fe, Cu, Mg, Mn, Co, etc. em concentrações bem reduzidas, porém necessárias. Meios constituídos apenas por estas substâncias são denominados de meios sintéticos. 8 8

SUBSTRATOS Monossacarídeos (glicose, frutose, galactose, manose, ribose, xilose, arabinose) Dissacarídeos: Sacarose (glicose + frutose) Lactose (galactose + glicose) Maltose (glicose + glicose) Trissacarídeos: Rafinose (glicose + frutose + galactose) Maltotriose (glicose + glicose + glicose) Polímeros de alto peso molecular: Amido (amilose + amilopectina) Amilose: cadeia linear de glicose ligações alfa 1-4 Amilopectina: cadeia ramificada com ligações alfa 1-4 e alfa 1-6 Celulose: polímero de glicose em ligações beta 1-4 Glicogênio: polímero de glicose com ligações alfa 1-4 e alfa 1-6 Pectina: polímero de ácidos galacturônico, raminose, arabinose e galactose

Perfil de Utilização de Fontes de Carbono

Meio de Cultivo Meios de cultivo preparados com fatores de crescimento: aminoácidos; Vitaminas (biotina, tiamina, riboflavina, etc.); Extratos de leveduras, extratos de malte, extratos de carne, peptona, hidrolisados de proteínas; 11

Meio de Cultivo Meios mais complexos e menos onerosos, por esta razão empregados na maioria dos processos fermentativos em grande escala: Caldo de cana-de-açúcar; Melaço, Cereais (trigo, milho, cevada, soja); Frutas (uvas, jaboticabas, laranjas, bananas) Estas matérias-primas são de composição química desconhecidas, mas os teores de açúcares, nitrogênio e fosforo, devem ser determinados para avaliar sua complementação ou não. 12

Considerações Finais A definição adequada do microrganismo a ser empregado, assim como do meio de cultura para este microganismo, é etapa fundamental para o sucesso de um processo fermentativo; No entanto, é sempre importante lembrar que a definição de um processo fermentativo mais adequado, assim como as preocupações com a recuperação do produto, são etapas da mais alta importância; 13

Considerações Finais Em alguns casos o emprego de microrganismos disponíveis em coleções de cultura pode levar ao desenvolvimento de processos produtivos que sejam atraentes; É necessário lembrar, no entanto, que presentemente se dispõem de muitos recursos para o aprimoramento de linhagens produtivas, o que torna os processos fermentativos cada vez mais promissores; 14

Considerações Finais Essas considerações trazem também um importante alerta sobre a constante necessidade de desenvolvimento do processo produtivo já instalado, justamente por essa grande variedade de desenvolvimentos possíveis; Presentemente e bastante dificial imaginar que uma dada empresa disponha do microrganimso “ótimo” ou do meio de cultura “otimizado”; É da mais alta importância que essa empresa continue a busca por melhores condições, em termos de microrganismos e de meio, caso contrário, poderá ser ultrapassada pela concorrente. 15

Prof. Dr. João Batista de Almeida e Silva Biografia Biotecnologia Industrial. Engenharia Bioquímica. SCHMIDELL, W. LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W. Editora Edgard Blucher, São Paulo, 2007. Prof. Dr. João Batista de Almeida e Silva joaobatista@debiq.eel.usp.br joaobatista@pq.cnpq.br 16

ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS Prof. Dr. João Batista de Almeida e Silva ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE FERMENTAÇÃO POR AQUECIMENTO A VAPOR MUITOS PROCESSOS FERMENTATIVOS EXISTEM A PRESENÇA DE MICORRGANISMOS ESTRANHOS “CONTAMINANTES”; EXEMPLO: 1. PINICILINA OS CONTAMINANTES PODEM PRODUZIR PENICILINASE; 2. FERMENTAÇÃO ACETONA-BUTANÓLICA, A BACTÉRIA PODE SER DESTRUÍDA POR VIRUS BACTERIÓFAGOS; OS CONTAMINANTES CONSOMEM AÇÚCARES E NUTRIENTES, COMPETINDO COM OS MICRORGANISMOS DE INTERESSE. O GRAU DE ELIMINTAÇÃO DOS CONTAMINANTES DEPENDE DE CADA CASO. Prof. Dr. João Batista de Almeida e Silva joaobatista@debiq.eel.usp.br joaobatista@pq.cnpq.br 17

ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS PROCESSOS DE ESTERILIZAÇÃO POR AQUECIMENTO PROCESSOS DESCONTÍNUO: O MEIO É COLOCADO NO FERMENTADOR E ENTÃO TODO O SISTEMA É AQUECIDO COM VAPOR. ESTERILIZA-SE O MEIO E O FEMENTADOR AO MESMO TEMPO, PODENDO SER POR VAPOR DIRETO OU INDIRETO; O AQUECIMENTO COM VAPOR DIRETO, PROVOCA DILUIÇÃO DO MEIO ENTRE 10 E 15%; A ESTERILIZAÇÃO DESCONTÍNUCA TEM AS SEGUINTES FASES: 1. AQUECIMENTO: elevação da temperatura próximo de 120 oc; 2. ESTERILIZAÇÃO: temperatura é mantida constante durante o tempo de esterilização; 3. RESFRIAMENTO: refrigera-se o sistema por serpentina ou pela camisa do fermentador. 18

ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS PROCESSOS DE ESTERILIZAÇÃO POR AQUECIMENTO A DESTRUIÇÃO TÉRMICA DOS MICRORGANISMOS OCORREM QUANDO A TEMPERATURA ESTÁ ACIMA DA TEMPERATURA MÍNIMA LETAL (80 A 100 oC). DESVANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO DESCONTÍNUA: Manutenção do meio em teperaturas relativamente altas por períodos longos, favorecendo o desenvolvimento de reações químicas e decomposição de nutrientes; 19

ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DESVANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO DESCONTÍNUA: a) Elevados consumos de vapores no aquecimento e de água no resfriamento; c) Problemas de corrosão nos equipamentos; d) Tempo não produtivo relativamente elevados, 20

ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA: Pode ser por vapor direto ou indireto também. O meio preparado é bombeado para um trocador de calor de placas ou tubos, A temperatura sobe instantâneamente e mantida por um determinado tempo de residência; O meio é enviado para outro trocador de calor para o resfriamento; O meio é enviado para um fermentador, já esterilizado; 21

ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA: ALGUNS VALORES NUMÉRICOS DE ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA a) vapor de aquecimento: vapor saturado (6,8 a 8,5 atm b) bombas de recalque do mosto não esterilizado podem ser bombas centrífugas, rotativas ou de pistão; c) tempo de enchimento do fermentador: não superior a 8 hs; d) temperatura de esterilização: 130 A 165 oC; 22

ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS VANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA: Temperaturas mais altas, porém tempos de permanência entre 5 e 10 minutos, o que diminui a destruição dos nutrientes melhorando a fermentação; Meios com densidade ou viscosidade altas, como mostos de cereais, o processo contínuo dispensa motores de potencia elevada, o que seria necessário no caso do processo descontínuo; 23

ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS VANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA: Economia de vapor, de água de resfriamento; Os esterilizadores podem ser utilizados nos processos de cozimentos e de sacarificação; 24

ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS CINÉTICA DA DESTRUIÇÃO TÉRMICA DOS MICRORGANISMOS: A VELOCIDADE DE DESTRUIÇÃO DEPENDE: a) dos microrganismos b) do meio c) da temperatura Do ponto vista cinético a destruição é dada pela equação de primeira ordem: onde: N= número de mo vivos após determinado tempo de aquecimento k= constante de destruição térmica 25

ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS CINÉTICA DA DESTRUIÇÃO TÉRMICA DOS MICRORGANISMOS: A VELOCIDADE DE DESTRUIÇÃO DEPENDE: a) dos microrganismos b) do meio c) da temperatura Do ponto vista cinético a destruição é dada pela equação de primeira ordem: onde: N= número de mo vivos 26