Polymerase Chain Reaction Biologia Celular e Molecular 2005/2006 Polymerase Chain Reaction Trabalho realizado por: Alexandre Sarmento Ana Catarina Gomes Ana Filipa Côrte Ana Filipa Lima Ana Sofia Sampaio Rita Cardona

PCR – Como tudo começou… Dezembro de 1983 A sua ideia: desenvolver um processo com o qual o DNA poderia ser multiplicado artificialmente através de ciclos repetidos de duplicação catalisada pela DNA polimerase Kary Mullis

Thomas D. Brock no lago do “Yellowstone National Park” de onde foi isolado o Thermus aqquaticus

Ganhou o prémio Nobel da Química! 10 anos mais tarde… Ganhou o prémio Nobel da Química!

Qual é o objectivo? Quais os componentes? Mg2+ DNA Polimerase dNTP Produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima Quais os componentes? Mg2+ DNA Polimerase dNTP Primers

Quais os instrumentos? Eppendorfs Termomixer Termociclador

Influência dos componentes na reacção de PCR DNA molde: deve estar livre de impurezas uma vez que estas podem inibir a reacção de PCR Solução tampão Tris: mantém o pH da solução Iões monovalentes: K+, Na+ e NH4+ optimizam as condições da reacção Soro de albumina de bovino: actua como proteína estabilizadora Ião Magnésio: - Baixa concentração: pouco ou nenhum produto - Elevada concentração: baixa especificidade. Primers Baixa concentração: induz má polimerização Elevada concentração: induz o aparecimento de produtos inespecíficos e formação de dímeros de primers

Nucleótideos (dNTPs) Baixa concentração: maior especificidade, com pouco produto final. Elevada concentração: há aumento da quantidade de produto com perda de especificidade. DNA polimerase DNA polimerase de Thermus aqquaticus (Taq polimerase) - Termoestável e sem actividade exonucleotídea 3’- 5’, ou seja, não tem actividade correctiva DNA polimerase de Pyrococcus furiosus (Pfu) - Termorresistente e com actividade exonucleotídea 3’-5’, ou seja, tem actividade correctiva

In vitro e a cores…

Vantagens Rapidez e facilidade na utilização: devido ao uso do “thermal cycler” e à síntese dos primers simplificada pelo uso do software dos computadores; Sensibilidade: o PCR é capaz de amplificar uma sequência de DNA correspondente a uma única célula; Robustez: o PCR permite a amplificação de sequências específicas de material cujo DNA está degradado ou embutido num meio do qual o isolamento do DNA é difícil.

Limites É necessária informação prévia da região de interesse O rendimento da técnica de PCR fica muito aquém do seu potencial máximo: Qualidade do DNA molde : contaminantes incluídos na amostra podem inibir a reacção Indisponibilidade de DNA devido a falhas/rupturas DNA ao dissociar-se de outras macromoléculas durante a purificação Diminuição da actividade da Taq polimerase ou a sua saturação Competição entre o produto obtido por PCR e os primers na ligação ao fragmento DNA a amplificar

Limites Taq polimerase não possui actividade de exonuclease no sentido 3’→ 5’ e por isso ocorrem erros (1 em cada 10000 pb); A utilização de “primers degenerados” diminui a sua especificidade podendo a sequência amplificada não corresponder a sequência de interesse;

RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) A amostra fornece o RNAm, que é convertido em cDNA Composta por 2 etapas: transcrição reversa - síntese de uma cadeia de DNA, utilizando-se como molde uma cadeia de RNAm, numa reacção catalisada por uma transcriptase reversa. São utilizados primers de oligonucleotídeos compostos por várias timinas consecutivas (6 a 35), complementares às regiões Poly-A do RNAm amplificação A avaliação do RNAm permite detectar quais as proteínas que estão a ser efectivamente expressas

Multiplex PCR Mais de um segmento genómico é amplificado numa única reacção, cada um com o seu par de primers específico Permite simplificar algumas experiências, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores genómicos devem ser analisados, reduzindo o tempo, trabalho e custo da genotipagem Aplicada em análises de delecção, mutações e polimorfismos

Nested PCR Composta por duas etapas: 1ª etapa – amplificação do DNA alvo. A complementaridade dos primers a locais alternativos, para alem do pretendido, implica obtenção de produtos não desejados 2ª etapa – o produto da 1º etapa submete-se a uma segunda reacção, com novos primers. É muito improvável que alguns dos produtos não desejados contenham os locais pretendidos para ambos os primers novos, assegurando a pouca contaminação do produto da segunda etapa Aumentar a sensibilidade e especificidade do método

PCR Competitiva Além do DNA molde, é adicionado à reacção um outro segmento de DNA, de sequência, tamanho e concentração conhecidos (controlo), cujas extremidades são também complementares dos primers que irão amplificar a sequência-alvo A amplificação do segmento controlo, tendo em conta a quantidade inicial e dados sobre a eficácia da reacção, serve de padrão para a quantificação do DNA alvo Esta técnica é utilizada principalmente em kits diagnósticos (ex: carga viral de HIV)

Construção de um fragmento controlo Enzima de restrição corta dois fragmentos de DNA: o do gene SDF-1α (alvo) e o do gene da β-actina Os fragmentos das bordas de SDF-1α são unidos com o interior do fragmento da β-actina híbrido de tamanho maior, amplificável pelos primers específicos de SDF-1α. Este híbrido é adicionado na reacção em quantidades pré-determinadas,

Real Time PCR Utiliza primers e dNTP`s marcados por compostos fluorescentes Termocicladores utilizados além de realizar os ciclos de temperatura, possuem leitores de fluorescência que fornecem dados sobre a quantidade de DNA formada durante a reação. Permite a detecção da fluorescência emitida durante a reacção como indicador do produto amplificado em cada ciclo da PCR (em tempo real) Aumento da fluorescência Ciclos de PCR

Qual a sua utilidade? Genetic fingerprinting Testes de paternidade Técnica forense, na qual pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime são amplificadas para serem analisadas Relações genéticas podem ser determinadas através de dois ou mais DNA fingerprints, que por sua vez podem ser usadas nos testes de paternidade Electroforese de fragmentos de DNA amplificados por PCR (1) Pai. (2) Criança (3) Mãe

Mutações Doenças virais Análise de DNA antigo Há situações nas quais se está interessado em fazer cópias de DNA mutado, por exemplo, ao tentar avaliar a função de um determinado gene ou na evolução in-vitro de uma proteina Podem ser detectadas usando PCR, através da amplificação do DNA viral. Esta análise é possível depois de uma infecção, que pode ocorrer muitos dias ou até muitos meses antes dos sintomas ocorrer. Um diagnóstico precoce oferece aos médicos um avanço significativo no tratamento DNA de um fóssil pode ser amplificado por PCR. Investigações têm tido sucesso em amplificar material genético de insectos fossilizados em amber que estão extintos há mais de 20 milhões de anos

Detecção de doenças hereditárias Clonagem de genes Um determinado gene pode ser amplificado com PCR usando os primers apropriados e então ser arranjado em sequência para detectar mutações. Assentam no isolamento de um gene de um organismo e a sua inserção noutro organismo. Clonagem de um gene usando um plasmídeo. (1) DNA cromossomal do organismo A. (2) PCR. (3) Multiplas cópias de um único gene do organismo A. (4)Inserção do gene no plasmídeo. (5) Plasmídeo com o gene do organismo A. (6) Inserção do plasmídeo no organismo B. (7)Multiplicação ou expressão do gene, originalmente do organismo A, ocorrendo agora no organismo B.

Antes, procurar o segmento pretendido na amostra… … era igual a encontrar uma agulha no palheiro Actualmente, com a técnica de PCR… … procurar o segmento pretendido na amostra …é igual a encontrar várias agulhas num só palheiro

Agradecimentos Professora Doutora Delminda Neves

Referências www.bio.davidson.edu/Courses/immunology/Flash/RT_PCR.html www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html www.pt.wikipedia.org Molina, A. L., Tobo P. R., Uso das técnicas de biologia molecular para diagnóstico, Einstein, 139-142 http://pt.wikipedia.org www.etall.hpg.com.br: Vieira D. P., Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações Maurizio Provenzano, MD, et tal, 2001, Scientific communication, 88-91