Começando a decifrar...

O fenômeno de restrição-modificação Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação. Arber, 1962 Nathans & Smith, 1962

Enzimas de restrição

Clivagem de restrição

Sítio de Restrição

Nomenclatura das enzimas de restrição EcoRI Escherichia coli BamHI Bacillus amyloliquefaciens RH BglII Bacillus globigii PvuII Proteus vulgaris HindIII Haemophilus influenzae Rd HinfI Haemophilus influenzae Rf Sau3A Staphylococcus aureus AluI Arthrobacter luteus TaqI Thermus aquaticus HaeIII Haemophilus aegyptius NotI Nocardia otitidis-caviarum

Fracionamento de DNA

Mapa de Restrição

Utilização do Mapa

Detectar mutações

Comparação de Mapas

Fracionamento de DNA

Como reconhecer o fragmento de interesse?

Complementariedade

Hibridação Calor ou pH = desnaturação

Reassociação Temperatura e força iônica

Sonda

Marcação da sonda

Estringência Reação de Hibridação e Lavagem: especificidade da sonda tamanho da sonda temperatura (T’m) força iônica Especificidade : identidade de seqüência Tamanho: fragmento/ oligonucleotídeo Temperatura: T’m - 25oC Força iônica: NaCl

Southern blot

Resultado

Hibridação in situ Localização de mRNA de ciclina (uma proteína que incita a célula a se dividir) = azul escuro Em azul claro os núcleos corados com DAPI

Southern blot Animação

O que fazer com o fragmento? Clonagem de DNA A clonagem permite a eternizar o fragmento Um pedaço de DNA de um eucarioto poderia ser produzido por um procarioto.

Vetores de clonagem O que deve ter uma molécula para ser um veículo de clonagem? 1. Replicação autônoma 2. Marcas de seleção 3. Sítio para clonagem

Sítio de clonagem O sítio de restrição deve estar nas duas moléculas a serem ligadas. Após a clivagem, as extremidades são recombinadas e a enzima LIGASE refaz a ligação fosfodiester.

Plasmídio recombinante

Transformação Hospedeiro: E.coli fenótipo e genótipo seleção, contenção, multiplicação

Hospedeira transformada

Clonagem molecular

Outro vetor? Bacteriófagos e, mais recentemente, cosmídios são utilizados como vetores de clonagem, principalmente quando se deseja inserir um fragmento de DNA com tamanho de ~40 kb. YACs - fragmentos maiores ainda.

Biblioteca Genômica Genoteca

Varredura de biblioteca

Seqüenciamento de DNA Princípios

Reação em cadeia de polimerização 1. Replicação

PCR 2. Amplificação

PCR - ANIMAÇÃO Um momento, por favor, estou carregando o programa.