Virologia Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II Fonte: slideshare: aula02-tecnicas-diagnostico-virologia-parte-2&user_login=HugoSousa1 Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II

Técnicas real-time PCR Biologia Molecular TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Detecção do genoma viral Futuro do diagnóstico de vírus Necessidade de equipamento e pessoal treinado Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time TÉCNICAS PCR Biologia Molecular Métodos de Amplificação Polimerase Chain Reaction (PCR) Restriction Fragment Lenght Position (RFLP) Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction (RT- PCR) Real-Time PCR Sequenciação Métodos de Hibridização Captura Híbrida Southern Blot Hibridização em tiras CHIPS Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Extração de Ácidos Nucléicos Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Extração Ácidos Nucléicos Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Extração Ácidos Nucléicos Lise alcalina; Neutralização; Precipitação de Proteínas e detritos celulares; Purificação Ácidos Nucleicos Precipitação Eluição em colunas Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Extração Ácidos Nucléicos Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Extração Ácidos Nucléicos Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Extração Ácidos Nucléicos Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Extração Ácidos Nucléicos Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Extração Ácidos Nucléicos Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Extração Ácidos Nucléicos Utilização Nucleases Remoção DNA Remoção RNA Add DNase + DNase (protein) Add RNase + RNase (protein) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Extração Ácidos Nucléicos Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Extração Ácidos Nucléicos Avaliação Ácidos Nucléicos por Espectofotometria UV Estimar a concentração de DNA e RNA a ~260nm. [dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL) [ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas de Amplificação AN Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Polymerase Chain Reaction Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Polymerase Chain Reaction Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Polymerase Chain Reaction Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Polymerase Chain Reaction Amplifica um fragmento de DNA especifico; Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir obter milhões de cópias do fragmento pretendido; Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de DNA de sequência conhecida; Região Alvo 5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’ 3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’ Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Polymerase Chain Reaction Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Polymerase Chain Reaction MISTURA DE REAÇÃO: DNA Primers: Oligonucleotídeos de cadeia simples com sequência complementar às sequências alvo do DNA (idealmente 20-24 nucleotídeos); Buffer: Solução tampão para estabilizar a reacção; Mg2+ (Magnésio): Ajuda na ligação dos nucleotídeos e estabilidade da Taq; dNTPs: Nucleotideos livres (A, T, C, G); Taq polimerase: Enzima termo-estável (+/-72ºC) que efetua a cópia da sequência alvo do DNA. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Polymerase Chain Reaction Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Polymerase Chain Reaction PROCEDIMENTO 1º Passo: Abertura do ADN cadeia dupla (T=95ºC); 2º Passo: Annealing/Ligação dos Primers (Ta~50 a 65ºC); 3º Passo: Activação da Taq polimerase (T~75ºC); 3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’ 5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’ ATCCGAT (…) – 5’ 5’ – (…) ATGCGTA Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Polymerase Chain Reaction Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Polymerase Chain Reaction PROCEDIMENTO 4º Passo: Repetição dos passos anteriores por 30-45 ciclos no máximo; FINAL: Obtenção de 2nºciclos copias do fragmento alvo. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Polymerase Chain Reaction Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Polymerase Chain Reaction Electroforese em Gel de Agarose: Separa as moléculas (proteínas ou ácidos núcleicos) de acordo com o seu peso molecular; DNA e RNA possuem carga elétrica negativa  migram para o pólo positivo (quanto mais pequenas mais migram); Brometo de Etídeo: corante fluorescente que se vai intercalar na dupla hélice de DNA e possibilitar a visualização dos fragmentos quando em exposição a luz UV; ( cuidado=> carcinógeno!) Amostras da PCR carregadas no gel; Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Polymerase Chain Reaction Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Polymerase Chain Reaction Pólo Positivo (+) Pólo Negativo (-) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Polymerase Chain Reaction Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Polymerase Chain Reaction APLICAÇÕES Detecção de sequências específicas de DNA viral Detecção AdV em amostras respiratórias Detecção EBV em biópsias Nasofaringe Detecção JCV em LCR ... DESVANTAGENS Altamente sensível à contaminação com quantidades residuais de DNA. Falsos positivos e artefatos. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia real-time PCR Técnicas Molecular RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Baseada na técnica da PCR; Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais); Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela atividade diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência específica) Presença de polimorfismo  Perda ou ganho de local de restrição  Variação no tamanho de fragmentos de DNA. 5’ – (…) ACTGA (…) – 3’ 3’ – (…) TGACT (…) – 5’ Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) APLICAÇÕES Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com patologias Detecção variantes EBV – Associação com agressividade ... DESVANTAGENS Todas as do PCR Sensível a contaminação por DNAses Artefactos Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Baseada na técnica da PCR; Análise de polimorfismos/mutações; Diferenças de sequência de um único nucleotídeo são suficientes para que cadeias simples de DNA adquiram uma conformação tri-dimensional diferente; Gel de Poliacrilamida permite correr as amostras (apenas em cadeia simples/desnaturadas) em função da sua conformação. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) APLICAÇÕES Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com agressividade ... DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações Leitura gel poliacrilamida Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Reverse Transcriptase PCR Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Reverse Transcriptase PCR Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Reverse Transcriptase PCR Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Reverse Transcriptase PCR Baseada na técnica da PCR; Análise de expressão de mRNA; Usa a enzima Transcritase Reversa para converter o mRNA em cDNA; Protocolo PCR para aumentar exponencialmente o número de cópias do mRNA; Molécula Alvo mRNA: 5’ – AUGCGUAUCGAUAUCGAUAAGCUA (…) AAAAAAAAA – 3’ TTTTTTTTTT – 5’ Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Reverse Transcriptase PCR Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Reverse Transcriptase PCR Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Reverse Transcriptase PCR Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Reverse Transcriptase PCR VANTAGENS Permite fazer análise quantitativa da expressão de mRNA. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Reverse Transcriptase PCR Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Reverse Transcriptase PCR APLICAÇÕES Expressão mRNA viral Avaliação da replicação viral DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Real Time PCR PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Real Time PCR PCR Biologia Molecular PCR was traditionally limited to end-point analysis using agarose gels Limitations of end-point PCR: Poor precision Low sensitivity Short dynamic range Low resolution Size-based discrimination Ethidium bromide for staining does not allow for accurate quantitation Requires post-PCR processing Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Real Time PCR PCR Biologia Molecular Monitora a fluorescência emitida durante a reação de PCR como um indicador da produções de amplicons em cada ciclo de PCR; Monitorização em tempo real; Detecção da amplificação nos estádios precoces da reação – maior precisão; Alvo: DNA ou RNA Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Real Time PCR PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Real Time PCR PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Real Time PCR PCR Biologia Molecular SYBR Green I Sonda de Hibridação Sonda TaqMan Sybr green * DNA binding dye * Binds to minor groove (dsDNA) * Emits light when bound More double stranded DNA = more binding = more fluorescence * Forensically, can be used to calculate how much DNA was present before reaction. * Unspecific Dissociation curve Taqman ) Denaturation and hybridization of probe. 2) Extension of primer and strand displacement of probe. 3) Cleavage of probe and fluorescence from the reporter dye. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Real Time PCR PCR Biologia Molecular Exponential If 100% efficiency – exact doubling of products. Specific and precise Linear High variability. Reaction components are being consumed and PCR products are starting to degrade. Plateau End-point analysis. The reaction has stopped and if left for long – degradation of PCR products. Plateau Linear Exponential Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Real Time PCR PCR Biologia Molecular Baseline – The baseline phase contains all the amplification that is below the level of detection of the real time instrument. Threshold – where the threshold and the amplification plot intersect defines CT. Can be set manually/automatically CT – (cycle threshold) the cycle number where the fluorescence passes the threshold Rn – (Rn-baseline) NTC – no template control DRn is plotted against cycle numbers to produce the amplification curves and gives the CT value. Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Real Time PCR PCR Biologia Molecular CT = threshold cycle Fracção dos ciclos de PCR a partir da qual é detectado sinal Quanto maior a quantidade de DNA, menor o valor de Ct Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Real Time PCR PCR Biologia Molecular Aplicações Quantificação carga viral Monitoração carga viral Monitoração terapêutica VANTAGENS Amplificação monitorizada em tempo real Ausência de processamento pós-PCR (baixo risco de contaminação) Requer pouca quantidade de amostra (DNA ou RNA) Rápido, específico, sensível e reprodutível Quantitativo Barato Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Sequenciação PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

3’ OH – necessário para adição do nucleotídeo seguinte Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Sequenciamento Usada para determinar a sequência de nucleotídeos Método de sequenciamento mais utilizado – método dideoxi Adição de dideoxinucleotideos que terminam a reação de polimerização 3’ OH – necessário para adição do nucleotídeo seguinte Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Sequenciamento PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Sequenciamento PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas de Hibridização Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas de Hibridização Biologia real-time PCR Técnicas Molecular Técnicas de Hibridização Alvo – DNA ou RNA Utilização de sondas específicas Possibilidade de diferenciação entre subtipos de vírus Técnicas Captura Híbrida Hibridização em tiras Southern Blotting CHIPS Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Captura Híbrida PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Captura Híbrida PCR Biologia Molecular Principio da técnica Hibridização de Ácidos Nucleicos Amplificação sinal por Quimioluminescência Método semi-quantitativo Método Hibridização amostras positivas com sondas específicas Complexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplaca Reação com anticorpo secundário conjugado com FA Adição de reagente e detecção por quimioluminescência Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Captura Híbrida PCR Biologia Molecular 45 minutes at 65ºC 60 minutes at 65ºC 15 minutes 30 minutes 60 minutes agitação Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Southern Blot PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Southern Blot PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Hibridização em tiras PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Hibridização em tiras PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Chips PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Chips PCR Biologia Molecular Tipagem de vírus: HPV, HCV, HIV Tubos ou lâminas com sondas específicas para cada subtipo Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Técnicas real-time Chips PCR Biologia Molecular Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

We ask the lab for a diagnosis, expecting a yes or no, but often end up with just a maybe… Professor Mark Pallen Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II

Virologia Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II Ano Lectivo 2010/11 Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II