Análise Qualitativa de Microrganismos Aline Alencar RA: 058691 Cintia Maruiama RA: 059773 Diogo de Oliveira RA: 060200 Gustavo Lloret RA: 048790 Pedro Aquino RA: 063624 Renan Joviliano RA: 064035

Sumário Atividades Bioquímicas do Microrganismos; Testes Bioquímicos; Controle de Qualidade de Medicamentos e Cosméticos; Provas Adicionais; Métodos Alternativos; Conclusão; Referências Bibliográficas.

Atividades Bioquímicas de Microrganismos Provas bioquímicas: identificação bacteriana baseada na detecção do perfil enzimático dos microrganismos. Antes do teste bioquímico, é necessário saber se o microrganismo é Gram-positivo ou Gram-negativo, pois para cada grupo existe um conjunto de provas. GRAM + GRAM -

Testes Bioquímicos

compostos orgânicos ácidos + H2 ou CO2 Provas Fermentativas Fermentações: reações bioquímicas produtoras de energia (moléculas orgânicas servem como aceitadores e dadores de elétrons). compostos orgânicos ácidos + H2 ou CO2 Hidratos de C e R-OH Condições: meio líquido, hidrato de carbono específico indicador de pH e tubo de Durham, que permite detectar a produção de gás.

Prova do Ácido Sulfídrico Aminoácidos sulfurados ou compostos sulfurados inorgânicos H2S Cisteína: o H2S é produzido pela hidrogenação (redução) do enxofre orgânico. Compostos sulfurados inorgânicos: o H2S é produzido a partir de sua redução. Ex. tiossulfatos (S2O32-), sulfatos (SO42-) e sulfitos (SO32-). Ágar SIM: uso do sulfato ferroso amoniacal como indicador, pois o ferro combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que é um precipitado negro insolúvel.

Hidrólise da Gelatina Determina a capacidade do microrganismo de secretar gelatinase, uma enzima hidrolítica extracelular capaz de degradar a gelatina. Se a degradação ocorre, as características de gel da gelatina não são passíveis de restauração, mesmo a baixas temperaturas, ou seja, torna-se líquido. - Principle:  Gelatin is a protein that is derived from collagen.  The gelatin molecule is to large to enter the cell as a whole so the exoenzyme gelatinase cleaves gelatin to polypeptides and then further degrades polypeptides to amino acids which are taken up and utilized by the cell.  When gelatin is converted to these smaller subunits it takes on a liquid form, this is the basis for this test + +

Prova do Indol Triptofano Indol Condições: meio de cultura que contenha o aminoácido triptofano e reagente de Kovac’s (amarelo), que reage com o indol produzindo um composto rosado. Culturas com um anel avermelhado na superfície são indol positivo. A persistência da coloração amarela do reagente demonstra que o substrato triptofano não foi hidrolisado a indol e indica uma reação negativa.

Prova da Urease Determina a capacidade do microrganismo para degradar a ureia através da enzima urease. É importante para identificar espécies de Proteus. Condições: meio de ureia de Christensen que contém também o indicador de pH, vermelho de fenol. Quando a ureia é degradada pela urease, a amônia acumula-se no meio tornando-o alcalino, o que transforma o meio amarelo em rosa. A ausência da coloração rosa indica uma reação negativa.

Prova da Oxidase Verifica a atividade da enzima citocromo oxidase, detectada em bactérias aeróbias, algumas anaeróbias facultativas e microaerófilas. É importante para distinguir grupos de bacilos Gram negativo patogênicos. Condições: reagente de oxidase (dihidrocloreto de tetrametil- p-fenilenodiamina). Após a adição do reagente o desenvolvimento da coloração rosa depois castanha e finalmente negra na superfície das colônias é indicativo da produção de citocromo oxidase e representa uma prova positiva.

Prova da Catalase catalase 2 H2O2 2 H2O + O2 Condições: substrato H2O2. Se houver liberação de bolhas de gás (oxigênio livre), a prova é positiva. A ausência de formação de bolhas de gás é uma prova negativa. Procedimento alternativo: determinar a produção de catalase adicionando uma porção de bactérias, previamente colocadas numa lâmina, com gotas de H2O2.

Prova da Coagulase É utilizada para distinguir espécies patogênicas de Staphylococcus de espécies não patogênicas, sendo um bom indicador da patogenicidade do S.aureus. Condições: plasma com anticoagulante, como o oxalato, citrato ou heparina, suspensão de microrganismos (caldo de cultura) ou colônias provenientes de um meio sólido. A formação de coágulos às 2 h, 6 h ou 24 h de incubação é interpretada como uma prova positiva. A ausência de coagulação após 24 h de incubação é uma prova negativa

Controle de Qualidade de Medicamentos e Cosméticos Conjunto de técnicas analíticas qualitativas, como o crescimento bacteriano em um meio sólido; Importantes microrganismos-chave a serem identificados, como: Pseudomonas aeruginosas Staphylococcus aureus Escherichia coli Salmonella sp.

Procedimentos As amostras podem ser semeadas em dois tipos de meio, de enriquecimento ou diferenciação, dependendo do microrganismo com o qual se está trabalhando; Para cada classe de bactérias existe um procedimento normatizado cuja recomendação é preconizada em compêndios

Staphylococcus aureus Ágar Baird-Parker – colônias pretas com halo transparente; Ágar Vogel-Johnson – colônias pretas com halo amarelo; Ágar-Manitol – colônias amarelas com halo amarelo.

Pseudomonas aeruginosa Ágar-Cetrimida – colônias esverdeadas, com fluorescência; Ágar Pseudomonas para Piocianina – colônias esverdeadas, com fluorescência azul; Ágar Pseudomonas para Fluoresceína – colônias claras e amarelas, com fluorescência amarela. hν

Escherichia coli Ágar MacConkey – colônias vermelho-púrpura, com halo de precipitação de bile; Ágar-Eosina com Azul de Metileno – colônias vermelho- escuras, com brilho metálico; Ágar-Endo – colônias rosadas, com brilho metálico.

Salmonella sp. Meios de diferenciação: Ágar Tríplice Açúcar-Ferro – colônias avermelhadas na superfície e amarelas no fundo, com precipitação de sulfeto de ferro; Meios de enriquecimento seletivo: Caldo Selenito-Cistina e Tetrationato de Bismuto – colônias pretas ou esverdeadas; Ágar Xililose-Lisina-Desoxicolato (XLD) – colônias vermelhas com núcleo preto

Provas Adicionais A utilização da microscopia pode ser uma importante ferramenta de análise qualitativa; A observação de uma suspensão bacteriana através de lâminas microscópicas permite a identificação de características como tamanho, forma, brilho e arranjo da colônia; Tais informações são importantes na categorização dos microrganismos.

Métodos Alternativos Constituem metodologias de vanguarda: automatizadas, rápidas e em sintonia com a agilidade desejável em uma industria; Normalmente, implicam alto investimento em equipamentos – análise de custo-benefício deve ser levada em conta; As análises podem ser baseadas na composição genética do microrganismo, seu metabolismo (e produtos dele) ou moléculas características que permitam sua identificação.

PCR (Polymerase Chain Reaction) Amplifica uma sequência específica de DNA de um genoma microbiano e pode, portanto, caracterizar a presença de um patógeno; Amplamente utilizado na determinação da qualidade de alimentos, pois permite avaliar a qualidade microbiana de forma rápida, com precisão, especificidade e potencial para detecção de baixos níveis de contaminação. Protocolos de extração de DNA não exigem o emprego de solventes, precipitação com álcool, ou outros tratamentos nas amostras que demandem em tempo de preparo antes da análise.

Aglutinação no Látex Rápida forma de se determinar a presença ou ausência de um antígeno ou anticorpo proveniente de bactérias; Se o antígeno ou anticorpo correspondente estiver presente, ocorrerá uma aglutinação da amostra em partículas visíveis, uma vez que a matriz (látex) estará impregnada com seu correspondente específico.

Imunofluorescência A utilização de anticorpos fluorescentes para diferentes epítopos pode ser indicada para identificar a presença de determinados microrganismos na amostra de interesse; A leitura pode ser realizada através da utilização de microscopia óptica com luz polarizada; A técnica permite a localização de proteínas sem que a colônia (biofilme) seja destruída.

Gene Reporter É um gene identificável qualquer utilizado para identificar outros genes específicos na cultura bacteriana, normalmente inserido em meio ao gene de interesse, reportando sua presença ou não no microrganismo; Determinados genes são escolhidos como reporters, pois conferem aos organismos que os expressam características facilmente identificáveis ou mensuráveis;

Conclusão Os métodos alternativos são, em primeira análise, mais onerosos que os convencionais, contudo, conferem maior exatidão, precisão e confiabilidade às análises; Além disso, o tempo hábil é um fator limitante em ambientes industriais, e isso deve ser levado em conta quando da escolha de uma metodologia; É importante ressaltar a enorme relevância da validação metodológica em todo e qualquer processo de controle de qualidade, de modo que os procedimentos sempre tenham reprodutibilidade.

Referências Bibliográficas Farmacopéia Brasileira, 4. Ed., São Paulo: Atheneu, 1988. pte. 1, p. 526; www.anvisa.gov.br - acessado em 08/10/2009;  PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; OHARA, M.T., “Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos”, São Paulo: Atheneu, 2000, p. 309;  Robert S. Dungan; April B. Leytem; “Qualitative and quantitative methodologies for determination of airborne microorganisms at concentrated animal-feeding operations”; World J Microbiol Biotechnol (2009) 25:1505– 1518.

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