'O Lago'-1928

Controle biológico de Produtos Farmacêuticos

Esterilidade (1932 na Inglaterra, primeiro teste) Conceito: total ausência de formas viáveis capazes de reprodução. Estatisticamente: esterilidade é um termo absoluto que não pode ser garantido. USP-33: a condição de esterilidade de um produto deve ser considerada quando o processamento ocorreu em condições adequadas e a análise de uma amostra representativa do lote, submetida ao teste de esterilidade, indique ausência de micro-organismos viáveis.

Teste de Esterilidade 14 dias tioglicolato caseína-soja 200 mL Produto Filtração em membrana 14 dias 200 mL porque são 2 testes (bactérias e fungos) tioglicolato caseína-soja 4

TESTE DE ESTERILIDADE “INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADO” negativo APROVAR O LOTE Revisão de registros da produção; Verificar possibilidade de contaminação acidental; Realizar RETESTE positivo positivo positivo negativo REPROVADO APROVADO negativo REPIQUE (+ 4 dias) positivo negativo REPROVADO APROVADO

Coleta de amostra Os testes de esterilidade e de pirogênio são realizados em diferentes etapas críticas do processo, mas seguindo o mesmo roteiro.

Amostragem: ( de acordo com a monografia ou tabelas) exemplos:

PREPARO DA AMOSTRA A natureza da amostra exige preparação prévia para que o resultado do teste seja válido

Cuidados: - Proceder a desinfecção externa dos frascos, ampolas, materiais de acondicionamentos ou embalagens com soluções anti-sépticas por imersão ou nebulização. Tempo de contacto determinado experimentalmente; - Solução para desinfecção: fenol 5%, álcool iodado, formaldeido 5%, álcool isopropílico,etc; - Violação da amostra somente no momento da inoculação no meio de cultura; - Agitar o frasco e retirar, assepticamente, um número suficiente de unidades, ou volume de cada meio.

Limitante do Teste de Esterilidade Os testes de esterilidade não detectam a presença de impurezas tóxicas. Impurezas tóxicas: substâncias que, por ação direta, ou indireta sobre um órgão, ou sistema passam a produzir alterações nocivas ao paciente. “Algumas dessas substâncias são classificadas como PIROGÊNICAS”

PIROGÊNIO São “COMPOSTOS” QUE, QUANDO EM CONTATO COM O SANGUE, DESENCADEIAM REAÇÃO FEBRIL Os pirogênios não são eliminados das preparações pelos processos de esterilização convencionais e também apresentam um elevado grau de termoestabilidade.

PIROGÊNIO FEBRE É definida como uma elevação controlada da temperatura interna do indivíduo acima dos níveis normais, decorrente da elevação do ponto de regulagem hipotalâmico. DINARELLO et al. 1988

PIROGÊNIO FEBRE É uma resposta fisiológica complexa a infecção ou lesão; É o primeiro componente da resposta de fase aguda (RFA) a ser observada na resposta inflamatória. Hasday et al., 2000 A RFA é uma reação imediata e complexa a agressões, como: Infecções: Bacterianas; Virais; Parasitária. Traumas: “Químicos”; Mecânicos; Térmicos; Necrose isquêmicas; Tumores “Tóxinas” Koj, 1996

PIROGÊNIO Histórico Centanni - última década do século XIX: isolamento de toxina bacteriana responsável pela febre; Hort e Penfold – febre das injeções (material estéril, porém pirogênio) 1912: teste de pirogênio em coelhos; Seibert - 1923: pirogênios filtráveis e termoestáveis. esterilidade ≠ apirogenicidade (exige controle em todos os estágios da produção) USP XII – 1942: desenvolvimento do primeiro teste oficial em coelhos; Shear e Turner – termo lipopolissacarídeo (LPS); Atualmente sabe-se que a porção lipídica do LPS, uma endotoxina, é responsável pelas reações biológicas.

Lipopolissacarídeo (LPS) Também conhecido como endotoxina é uma molécula altamente tóxica derivada da membrana celular externa de bactérias gram-negativas.

Estrutura do LPS Fonte: GIROIR, B.P. Mediators of septic shock: new approaches for interrupting the endogenous inflammatory cascade. Crit. Care Med., v.21, p. 780-9, 1993.

(presente na parede das bactérias Gram -) LPS (presente na parede das bactérias Gram -) O antígeno O (polissacarídeos) varia em composição e comprimento entre as bactérias Gram -; O núcleo e o lipídeo A são mais constantes. (conservados entre diferentes espécies) ; O lipídeo A é o principal responsável pela toxicidade da endotoxina.

PIROGÊNIO Endotoxina Nos produtos farmacêuticos podem ser encontradas unidades não purificadas nas etapas do processo, ou no produto acabado – POR ISSO USA-SE A TERMINOLOGIA ENDOTOXINA; Para a industria farmacêutica o termo endotoxina se refere a LPS, o pirogênio mais significativo.

(exógena, estão no interior do corpo mas foram “formadas” fora) PIROGÊNIO Endotoxina (exógena, estão no interior do corpo mas foram “formadas” fora) Alto peso molecular Membrana externa de bactérias Purificadas – lipopolissacarídeos (LPS) Termoestáveis Inativação - ciclos extensos de calor seco, condições alcalinas ou ácidas Atividade biológica - porção lipídica

Classes de PIROGÊNIO Mediador primário da febre endógeno exógeno resposta a pirogênio (toxina) exógeno Produzido internamente pelo hospedeiro exógeno Lipopolissacarídeo (endotoxina) Induzem a febre quando injetados Mediador primário da febre

pirogenicidade unidade lipídica da endotoxina PIROGÊNIO pirogenicidade unidade lipídica da endotoxina Mecanismo da febre Fagocitose do lipídeo A Produção pirogênio endógeno Atravessa barreira hematoencefálica Regulação da temperatura Prostaglandina E2 e AMPc

Níveis aceitáveis de pirogênios: Parenterais de grande volume - 0,5 EU/mL Água para injeção - 0,25 EU/mL Drogas intratecais - 0,2 EU/mL Solução salina - 0,5 EU/mL Solução glicose injetável 5% - 0,5 EU/mL EU/ mL = unidades de endotoxina por mL

PIROGÊNIO TESTES Os testes para determinar a presença, ou não de pirogênio em uma amostra pode ser in vitro ou in vivo.

(a USP – 33 recomenda qual a ser usado) PIROGÊNIO MÉTODOS ANALÍTICOS (a USP – 33 recomenda qual a ser usado) Ponto final de geleificação Ensaio turbidimétrico Método cromogênico Outros…

TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VITRO 1885 – sangue de Limulus polyphemus formava um coágulo em gel sólido; Amebócitos- única célula circulante encontrada no sangue de Limulus polyphemus ; Posteriormente – bactérias marinhas Gram (-) provocavam coagulação intravascular e morte dos caranguejos; Origem: Derivado termoestável das bactérias; 1964 – Levin e Bang: (1) amebócitos eram necessários para a reação, (2) quantidades de endotoxina eram inativadas na reação

Limulus polyphemus

Tachypleus gigas (in Indonesia)

PIROGÊNIO MECANISMO DA REAÇÃO reação é dependente da ativação da enzima de alto peso molecular pela endotoxina (dependente de Ca++ e outros íons bivalentes) (2) geleifica proteínas coaguláveis de baixo peso molecular (coagulógeno)

Cascata de coagulação

Preparo do lisado do amebócito de Limulus (LAL) PIROGÊNIO Preparo do lisado do amebócito de Limulus (LAL) Sangria do caranguejo Lavagem do amebócito Liberação do conteúdo intracelular do amebócito Liofilizar LAL introduzido na USP XX e 4a. Edição Farmacopéia Brasileira 1996

PIROGÊNIO MÉTODOS ANALÍTICOS Ponto final de geleificação (LAL + solução teste incuba a 37±1ºC por 1 hora (+-2`). Observar formação do gel (inverter cuidadozamente o tubo para 180º) Ensaio limite Sensibilidade: 0,25 a 0,015 EU/mL

Outro método: MÉTODO CROMOGÊNICO CURVA PADRÃO PIROGÊNIO Outro método: MÉTODO CROMOGÊNICO CURVA PADRÃO LAL + EU/mL (incuba 10 min 37 ºC) Substrato cromogênico (37 ºC) (20 min a 37 ºC) ácido acético (interromper a reação) Leitura a 405 nm

Teste de Pirogênio (MÉTODO CROMOGÊNICO) Padrões Amostra (em triplicata*) 0,05 (10%) 0,25 (50%) 0,50 (100%) 0,75 (150%) 1,00 EU/mL (200%) * C1 C2 C3 + LAL 10 min, 37ºC + substrato cromogênico 20 min, 37ºC + ác. acético leitura (405 nm) * USP 33

Resultado (exemplo) C (EU/mL) A (405 nm) 0,05 0,060 0,25 0,300 0,50 0,600 0,75 0,900 1,00 1,200 C1 0,097 C2 0,082 C3 0,086

Resultado (exemplo) C = 0,088 EU/mL C1 = 0,080 EU/mL A = 0,288C - 0,252 R2 = 0,9983 C = 0,088 EU/mL

Fluxograma Recebimento das amostras Preparo da sala de esterilidade. Desinfecção com nebulizador Paramentação dos analistas Vestimento de roupa, sapato e EPEI’S estéreis na ante-sala Entrada na sala de esterilidade Aspiração da amostra com seringa e transferência para frasco estéril Preparo da amostra (em triplicata)

Fluxograma (continuação) Adição de 0,1 ml de cada diluição em frasco de L.A.L com 0,1 ml de reagente de L.A.L. Incubação 10 min, 37ºC Adição substrato cromogênico Incubação 20 min, 37ºC Adição ácido acético Leitura (405 nm) Não mais que 0,5 EU/mL Mais que 0,5 EU/mL Produto aprovado Produto reprovado

PIROGÊNIO APLICAÇÃO Utilizado em produtos parenterais, água para injeção e em fluidos biológicos Método extremamente sensível, específico,reprodutível, simples e rápido.

TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VIVO

TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VIVO - Ensaio limite Aprovar ou rejeitar uma amostra mediante as variações do estado febril de um grupo de coelhos Cada grupo de animais (coelhos) recebe injeção intravenosa da amostra e é observado durante um período de 3 horas Pontos a serem considerados: Valor igual ou maior que 0,6 ºC Somatória de elevação térmica individual de todos os animais testados Valores até 0,6ºC podem ser considerados normais

EXIGÊNCIAS PARA O TESTE PIROGÊNIO EXIGÊNCIAS PARA O TESTE - Material utilizado (vidraria, injeção) - despirogenizado, tratamento térmico (250 graus por 1 hora) ou material apirogênico descartável - Animal sadio - Avaliação do peso do animal equivalência entre as espécies; Injetáveis de grande volume (10 mL/Kg) Raça de escolha Triagem dos animais em relação à resposta febril – indução de tolerância Inoculação de nucleianato sódico 5 mg/Kg – resposta febril de 0,8 a 1,2 ºC Treinamento dos animais - tempo para resposta febril Reutilização dos animais Descanso de 2-3 dias quando material apirogênico Descanso de 2-3 semanas quando material pirogênico Atenção com doses sub-pirogênicas mecanismo de tolerância - Controle da temperatura fisiológica

PIROGÊNIO AMOSTRA Injetáveis, equipos de transfusão, infusão, dispositivos implantáveis ou descartáveis Injetáveis de grande e pequeno volume Produtos em forma de aerossol Via de administração intratecal (a endotoxina é 1000 vezes mais potente) Material plástico (preferência pelo LAL)

Fármacos que atuam sobre o sistema termo-regulador PIROGÊNIO AMOSTRA - Grande volume e líquidos extratores: 10 mL/Kg - Velocidade da injeção: 4 a 6 mL/min (não ultrapassar 4 min) - Temperatura da amostra: 37 a 38 ºC Fármacos que atuam sobre o sistema termo-regulador Produtos incompatíveis com a metodologia animal: hipnóticos, anestésicos, gluconato de cálcio, radiofármacos

(coelhos adultos de 1,5Kg aproximadamente) PIROGÊNIO ANIMAL (coelhos adultos de 1,5Kg aproximadamente) Manuseio do animal é fundamental Suspender alimentação no dia do ensaio Determinar temperatura corporal basal (40 a 90 min antes da injeção, 3 determinações a cada 30 min) Solução teste na veia marginal da orelha Registro temperatura corporal – 3 horas Ideal: tomada contínua da temperatura

AMOSTRA APROVADA UMA DAS CONDIÇÕES NÃO ATENDIDA – RETESTE PIROGÊNIO INTERPRETAÇÃO USP XXXIII e Farmacopéia Brasileira IV Duas condições PARA RESULTADO NEGATIVO (liberar lote): Todos os animais com elevação térmica crítica ≤ 0,6oC Somatória da elevação térmica dos 3 coelhos < 1,14oC AMOSTRA APROVADA UMA DAS CONDIÇÕES NÃO ATENDIDA – RETESTE + 5 animais – não mais que 3 animais devem acusar elevação térmica crítica ≥ 0,6oC Valor da somatória (8 animais) não deve exceder 3,7 oC

Teste in vivo (vantagem) PIROGÊNIO Teste in vivo (vantagem) Detecta qualquer contaminante estranho capaz de ser detectado pelo teste animal

PROCESSOS DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DAS ENDOTOXINAS PIROGÊNIO PROCESSOS DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DAS ENDOTOXINAS Hidrólise ácido-base Separa o lipídeo A do restante da molécula do LPS Altera a conformação (lipídeo A) em sítios funcionais essenciais HCl 0,05 N por 30 min a 100 ºC Ácido acético glacial 1,0% por 2-3 horas a 100 ºC Oxidação H2O2 – oxidação dos ácidos graxos presentes no lipídeo A do LPS Inativação dependente do tempo, pH e concentração Outros: O2 molecular, ácido hipocloroso ou hipoclorito, ácido periódico, permanganato de potássio diluído Alquilação Anidrido acético e succínico- redução de 100 a 1000 vezes Óxido de etileno- redução significativa de endotoxinas Maiores informações – quantidade de endotoxinas Calor seco Materiais termo resistentes: frascos de vidro, instrumentos metálicos 250 ºC/30 min – mecanismo incineração

DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DE ENDOTOXINAS PIROGÊNIO DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DE ENDOTOXINAS Lavagem (aplicação em embalagens) Lavagem com solvente apirogênico – água estéril para injeção Destilação (aplicação em água) Mudança de estado físico Moléculas de LPS são grandes e de elevado peso molecular Água recém destilada é estéril e apirogênica Ultrafiltração (aplicação em antibióticos) Exclusão por peso molecular Osmose reversa (aplicação em água) Membrana de acetato de celulose ou poliamida Remoção de endotoxinas por exclusão (porosidade 10 Aº)

OBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÊNICOS PIROGÊNIO OBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÊNICOS Processo produtivo em condições adequadas de higiene Operadores: qualificado e treinado Matéria-prima com baixa carga microbiana Processos validados Ambiente Boas práticas de fabricação Monitorização do processo (técnicas analíticas validadas – in vivo e in vitro)