Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos Obtenção do material: Vírus Bactérias; fungos Célula vegetal / célula animal

Extração de ácidos nucléicos Requerimento essencial: quantidade (rendimento) pureza integridade Etapas na obtenção de ácidos nucléicos: Lise física ou bioquímica das paredes celulares e membranas Purificação dos ácidos nucléicos: desnaturação / inativação de proteínas celulares Precipitação

Extração de ácidos nucléicos 1. Rompendo membranas celulares Lise das células  liberação dos componentes citoplasmáticos e/ou nucleares Estratégia: de acordo com o tipo de célula envolvida: (deve ser o mais “gentil” possível) - bactérias (parede glicoproteica)  tratamento inicial com lisozimas (orifícios na parede  enfraquecimento  rompimento em solução hipotônica); outras soluções alternativas: temperatura elevada; sonificação

Extração de ácidos nucléicos Células de plantas ou animais presentes em tecidos: Pré tratamentos adicionais para romper a matriz tecidual  célula individual  lise: digestão enzimática / homogeneização Célula vegetal – parede celular: tratamento mecânico para promover lise.

Extração de ácidos nucléicos Células sem cobertura externa ou em solução: Sem tratamentos agressivos – tratamento com detergente – SDS (SODIUM DODECYL SULFATE) – dodecil sulfato de sódio  substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos e dissolvendo proteínas de membranas solução de lise: NH4Cl / NH4HCO3

2. Desnaturando proteínas celulares: Lisados celulares contêm mistura complexa de macromoléculas: - DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos. Fragmentos de membrana lipídica Proteínas intracelulares: enzimas nucleases degradativas – DNAses / RNAses  interferem no rendimento dos ácidos nucléicos Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos: Extração em baixas temperaturas Incubação dos lisados com reagentes desnaturan- tes de proteínas Agentes que retardam atividade das nucleases:

Extração de ácidos nucléicos Agentes que retardam atividade das nucleases: tampões de extração com agentes quelantes (EDTA – ácido etileno diaminotetracético) Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico  desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração RNA- inibir Rnases (proteinase K; DEPC – dietil pirocarbonato )

Extração de ácidos nucléicos 3. Separando DNA / RNA / Proteínas Extração por solventes - precipitação e/ou centrifugação Extração com fenol – solvente orgânico; desnatura proteínas; permite isolamento de DNA e proteínas (emprega solubilidade diferencial de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos no fenol) Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 3 fases: aquosa (ácidos nucleicos) interface: proteínas camada do fenol

Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: Extração de DNA (fenol com pH neutro ou básico) 3 fases: aquosa (ácidos nucléicos: DNA e RNA) interface: proteínas camada do fenol Camada aquosa Camada de proteínas Camada do fenol pH neutro ou básico pH

Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: Extração de RNA (fenol com pH ácido) 3 fases: aquosa (RNA) interface: proteínas camada do fenol (DNA) Camada aquosa Camada de proteínas Camada do fenol pH ácido pH

Extração de ácidos nucléicos 4. Precipitação e lavagem com álcool DNA: Ressuspender DNA em TE pH 8,0 – (Tris-HCl / EDTA), até completa dissolução – Armazenar a 4ºC  -20º C DNA precipitado

Extração de ácidos nucléicos 4. Precipitação e lavagem com álcool RNA: Ressuspender RNA em água estéril (DEPC) – incubar à 55 – 65ºC por 10 minutos (inativar RNAse) – armazenar `a -80ºC RNA precipitado

Extração de ácidos nucléicos com fenol RNA DNA Camada aquosa (RNA) Interface (proteínas) Camada de fenol (DNA) Fenol pH ácido Fenol pH neutro/alc. DNA pptado RNA pptado

Extração de ácidos nucléicos a partir de sangue total

Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos

Gel de agarose 1% com 3 ml de DNA genômico M - Marcador 1, 2 e 3 - amostras de DNA genômico

Extração de ácidos nucléicos Soluções utilizadas tampão de extração solução de lise solução desnaturante de proteínas fenol clorofórmio Etanol Proteinase K

Extração de ácidos nucleicos Função dos reagentes Tampão: proporciona um pH ideal para manutenção da integridade das moléculas de ácidos nucléicos; inibem atividade de desoxirribonuclease; ex.: TE - pH 8,0 (Tris-HCl / EDTA – ácido etilenodiamino tetracético). Detergentes: substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucléicos e dissolvendo os lipídios de membrana; SDS = sodium dodecyl sulfate. Fenol: desnatura proteínas, permitindo o isolamento de DNA/RNA de amostras biológicas.

Extração de ácidos nucléicos Função dos reagentes Clorofórmio: desnatura proteínas aumentando a eficiência da extração de ácidos nucléicos. Inibidores de nucleases: quelante de Mg++(EDTA) DEPC – dietil pirocarbonato). Etanol: induz alterações estruturais nas moléculas de ácidos nucléicos provocando a agregação das moléculas, seguida de precipitação (remove resíduos de fenol e clorofórmio). Proteinase K – a contaminação com proteínas pode ser removida pela digestão com proteinase K