Identificação e caracterização de genes e fatores relacionados à floculação e desenvolvimento de uma levedura industrial não floculante Aline Rodrigues Orientação: Dr. Gonçalo A. G. Pereira Projeto de Doutorado

Sumário PARTE I Leveduras industriais Floculação Objetivos Metodologia PARTE II Genes relacionados ao estresse oxidativo Objetivos Metodologia / Resultados Parciais

PARTE I FLOCULAÇÃO

LEVEDURAS INDUSTRIAIS Principais fatores que influenciam no processo de fermentação para produção de etanol Capacidade fermentativa das leveduras Resistência das leveduras às condições de estresses submetidas Leveduras iniciais Leveduras selvagens Isoladas BG-1 (Usina Barra Grande) CR-1 (Usina Cresciumal) SA-1 (Usina Santa Adélia) CAT-1 (Usina Catanduva) PE-2 (Usina da Pedra)

LEVEDURAS INDUSTRIAIS.Linhagens selvagens selecionadas pela capacidade de predominar sob as condições físico, química e microbiológicas presentes na dorna.Condições de estresse adverso: alta contaminação bacteriana alta acidez altas temperaturas ? AGREGADOS MULTICELULARES - FLOCULAÇÃO!! -

PROBLEMAS CAUSADOS PELA FLOCULAÇÃO Floculação  Decréscimo de rendimento  Prejuízos !!!. Redução da área de contato das leveduras com o meio. Problemas na circulação do líquido nas tubulações. Reversível  dependente de cálcio Controlado geneticamente!!

GENES RELACIONADOS À FLOCULAÇÃO FAMÍLIA FLO FLO1 FLO5 FLO9 FLO10 OUTROS GENES ? FLO8 MSS11 GTS-1

Floculação  controlada por 3 genes FLO8 outros 2 genes desconhecidos

OBJETIVOS Desenvolver uma levedura industrial que não apresente o fenótipo floculante, independente das condições encontradas nas dornas. Objetivos específicos:. Identificar e caracterizar os genes reguladores envolvidos no processo de floculação;. Desenvolver mutantes para os genes selecionados em uma linhagem de levedura de laboratório. Desenvolver mutantes para os genes selecionados em uma linhagem de levedura industrial Demais objetivos: Identificar características gênicas de linhagens industriais relacionadas com resistências a estresses presentes nas dornas.

outros 2 genes desconhecidos MAPEAMENTO Comparação do genoma entre isolados haplóides originários da mesma linhagem, mas com características distintas quanto ao fenótipo floculante. SEQUENCIAMENTO Identificadas composições de genes diferentes para cada isolado e polimorfismos nos variados alelos Seleção dos GENES ALVOS METODOLOGIA FLOCULAÇÃO - IDENTIFICAÇÃO DOS GENES DE INTERESSE

Seleção dos GENES ALVOS Estudos de transformação para desenvolvimento de mutantes FLOCULAÇÃO - DELEÇÃO DE GENES ESPECÍFICOS Delitto Perfetto - nenhuma marca de seleção será deixada no final do processo de deleção de cada locus ENSAIOS DE FLOCULAÇÃO Leveduras serão desfloculadas, ressuspendidas em tampão de floculação; A floculação será induzida por Ca 2+ ; Capacidade de floculação: F=(1-B/A)x100%, onde A=A 600 antes das células serem agitadas em tampão de floculação e B=A 600 após 6 min sem agitação

ENSAIOS DE FLOCULAÇÃO – PE-2 não flocula em laboratório!! - Ensaios de laboratório - tentativas para induzir a floculação da PE-2 diferentes temperaturas diferentes concentrações de bactérias contaminantes variação de pH

PARTE II ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVO

PARTE II ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVO ESTRESSE OXIDATIVO OUTRAS CONDIÇÕES ADVERSAS desafios que as leveduras encontram nas dornas para sobreviver e fermentar SNO/SNZ MPR resistência a alguns fenômenos de estresse Estudo pode ser importante para a manipulação genética de leveduras industriais

PARTE II ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVO GENES SNO/SNZ EM LEVEDURASSNZSNZ2 SNZ1 SNZ3 SNO Coregulados durante a fase de crescimento até a fase estacionária e durante a limitação de nutrientes

SNO e SNZ em leveduras – envolvidos na síntese de vitamina B6 e vitamina B1 PARTE II ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVO GENES SNO/SNZ EM LEVEDURAS S288c SNO1/SNZ1 - região mediana do braço direito do cromoss. XIII SNO2/SNZ2 - braço esquerdo do cromoss. XIV SNO3/SNZ3 -braço esquerdo do cromoss. VI Teloméricos!!

PARTE II IMPORTÂNCIA DAS VITAMINAS B1 E B6 EM LEVEDURAS INDUSTRIAIS Vitamina B6 Metabolismo de aminoácidos Forma biologicamente ativa PLP Em S. cerevisiae Precursor da tiamina (Vitam. B1) Vitamina B1 Cofator tiamina pirofosfato Essencial para a utilização do açúcar Fermentação ALTA DEMANDA DE TIAMINA NOS AMBIENTES INDUSTRIAIS !!! AUMENTO DA REGULAÇÃO DOS GENES DE METABOLISMO DA TIAMINA EM LEVEDURAS DE FERMENTAÇÃO E DE DIVERSOS AMBIENTES INDUSTRIAIS

TIAMINA NO MEIO Efeito negativo Fase inicial de crescimento das células de levedura Consequência do efeito repressor de tiamina na biossíntese de PLP Diminuição resultante no conteúdo celular da vitamina B6 Muitas vias metabólicas são reprimidas PARTE II IMPORTÂNCIA DAS VITAMINAS B1 E B6 EM LEVEDURAS INDUSTRIAIS

. CNVs (variação no número de cópias)- genoma de 5 linhagens industriais. 72 CNVs exclusivas de linhagens industriais –importantes amplificações dos genes teloméricos SNO e SNZ - SNO2/SNZ2 e SNO3/SNZ3. Linhagens industriais – perderam genes SNO/SNZ do cromoss. VI, mas apresentaram hibridizações em vários outros cromossomos

Inibição do crescimento induzida por tiamina/açúcar linhagem de laboratório S288c Nenhuma das cinco leveduras industriais apresentaram o fenótipo de crescimento tiamina-repressível

PARTE II ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVO GENES MPR EM LEVEDURAS MPR – pode conferir uma vantagem adaptativa às condições adversas das dornas de fermentação : estresse oxidativo, resistência à temperatura elevada e alta concentração de etanol Diminuição de níveis intracelulares de ROS quando as células de levedura são expostas à condições de estresse oxidativo como choque térmico, peróxido de hidrogênio, congelamento ou tratamento com etanol

SNO/SNZ e MPR - número de cópias elevado linhagem industrial X linhagem de laboratório (S288c) Vantagem adaptativa Bom desempenho fermentativo

Objetivos específicos: Analisar esporos de uma linhagem industrial (PE-2), relacionando o número de cópias desses genes (SNO/SNZ e MPR) com a eficiência nos ensaios fermentativos e resistência a estresses PARTE II ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVO OBJETIVOS Identificar características gênicas de linhagens industriais relacionadas com resistências a estresses presentes nas dornas

OBTENÇÃO DOS ESPOROS HAPLÓIDES Asco Esporulação Dissecção de tétrades PARTE II ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVO RESULTADOS PARCIAIS 30 tétrades linhagem PE-2 (isolado JAY270) 120 esporos haplóides 4 esporos viáveis

120 esporos haplóides PARTE II ESTUDOS DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVO RESULTADOS PARCIAIS PFGE Transferência dos géis de PFGE para membranas de hibridização Southern-blot Segregação dos genes SNO/SNZ e MPR Avaliar o número de cópias desses genes em cada esporo haplóide isolado, e localização cromossômica Ensaios fermentativos e de resistência a estresses

CARIOTIPAGEM POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis)

Construção das Sondas GenesPrimers SNO/SNZ SNO/SNZ F: 5’TACGGATTTGTAAGAGTTCCT3’ SNO/SNZ R: 5’CCCAAATGTATTGCATATGAC3’ MPR MPR1 F: 5’TTCAACCGTTAGCCGACTCT3’ MPR1 R: 5’ATGAGGCACCAGTCCAATTC3’

SOUTHERN-BLOT – GENES SNO/SNZ

PRÓXIMAS ETAPAS DO PROJETO FLOCULAÇÃO Deleção do gene FLO8 Ensaios floculação – PE-2 GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE OXIDATIVO Análises de Southern-blot Ensaios fermentativos e resistência a estresses

Obrigada!!!