RT-PCR em Tempo Real Especificidade Sensibilidade Reproductibilidade Robustez

Problemas inerentes à PCR Amplificação inespecífica Dímeros de primer Eficiência da amplificação Formação de hetero-duplex Estes problemas podem ser evitados fazendo um BOM desenho de primers

Desenho de primers Avaliem sua seqüência:>20 phred, exon-exon Padronizar tamanho do amplicon: 95-105 bp Padronizar Tm: 60º C (59-61) ou %GC 5% maior do que a média do genoma (High GC) Padronizar tamanho do primer (19-21 nt) Até 2 G+C nos últimos 5 nt da 3’ do primer Máximo de homopolímeros de G ou C = 3 nt Para genes normalizadores pegar junção exon-exon

Problemas inerentes à RT Qualidade do RNA: Extração em paralelo usando mesmo protocolo Verificar em gel e nanodrop Qualidade do sscDNA: preparar imediatamente após extração do RNA de boa qualidade Usar random primer Confirmar qualidade amplificando um gene de referência Fazer quantidade suficiente para todo o experimento Não esperem meses para começar

Expressão gênica relativa Relativa a que? Gene de referência (normalizador): Gene que não sofre regulação nas condições do experimento. É necessário para padronizar a quantidade de sscDNA das diferentes amostras. Condição de referência (controle): É a condição que serve de “zero” para saber se nosso gene de interesse é induzido ou reprimido nas condições problema.

Gene normalizador Referência bibliográfica não é suficiente! Escolher vários genes (3-12) envolvidos com metabolismo basal: Ribossomais, fatores de elongação, processamento do DNA, citoesqueleto, etc. Avaliar esse genes nas condições do experimentos através do GeNORM

Dados de fluorescência Threshold Threshold: fixa na fase exponencial, numa região aonde as curvas estão parelas umas as outras e acima do baseline indicado pelo NTC Ct ou CP: número de ciclos aonde a amplificação atinge o threshold Experimentos em múltiplas placas: fixar o threshold

Curva padrão e eficiência Pool de RNA Usar um intervalo amplo de concentrações => 5 concentrações FD10 em triplicata R2 ~0,99 E = [10^(-1/slope)] - 1, deve estar entre 0,65 e 1

Curva padrão

Curva padrão

Curva de melting Permite verificar especificidade da reação Fazer sempre!

Modelos matemáticos Método do Delta Ct Expressão relativa do gene A na condição X: DCP= CPA – CPR

Modelos matemáticos O método presupõe que eficiência de amplificação é eqüivalente para o gene alvo e o gene normalizador É necessário um ensaio de validação: Gráfico log de input amount (ng RNA) vs. DCt deve ter uma inclinação ~0 Diferença de 3% na eficiência da um erro de 47% (Et<Er) ou de 209% (Et>Er) após 25 ciclos!

Modelos matemáticos Método Pfaffl: Corrige pela eficiência de amplificação Aceita apenas um gene normalizador

Modelos matemáticos Método da curva padrão: Para gene A na amostra X corrige o valor da média de Ct pelo dados da curva padrão Input amountA,X= 10^[(CtA,X – valor-Y)/slope] O input amount deve ser normalizado pelo input amount do gene normalizador (R) em X, ou pelo valor do GeNORM para X RazãoA,X = Input AmountA,X/Input amountR,X

Razão = RazãoA,X/RazãoA,C Modelos matemáticos Finalmente, o input amount normalizado é expresso em valores relativos à condição de referência (controle) em fold change RazãoA,C = input amountA,C/input amountR,C Razão = RazãoA,X/RazãoA,C Se Razão < 1, expressa -1/Razão (fold change)

Uso do GeNORM Avalia a estabilidade dos genes normalizadores Calcula a média geométrica dos input amount para os melhores genes normalizadores em cada condição Para cada condição dá um valor de normalização que pode ser usado diretamente Uso do GeNORM dá maior robustez aos dados

Uso do GeNORM Fazer uma tabela com colunas para cada gene e linhas para cada condição Calcular o input amount para cada gene em cada condição Substrair dos valores em cada coluna o maior valor Usar os valores resultantes como expoentes da base 2 Eliminar os genes com valores muito diferentes de 1 Calcular a média geométrica dos genes aceitos

Bibliografia Anonymous. 1997. ABI Prism 7700 Sequence detection system. User Bulletin #2: Relative quantitation of gene expression. 1-36 p. Vandesompele. 2002. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology, 3(7): 0034.1-0034.11 Pfaffl. 2004. Chapter 3. Quantification strategies in real-time PCR. In: A-Z of quantitative PCR (Editor: SA Bustin). International University Line, La Jolla, CA: 87-112 p. Wong. 2005. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques 39(1): 1-11 Guidelines: http://www.rdml.org/guidelines Glossário: http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html