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Real Time PCR
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O Que é? Reação de PCR cuja detecção dos amplicons é simultânea a amplificação, não necessitando de etapas posteriores como gel de eletroforese ou detecção radioativa , “like” ELISA ou Blots.
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Tipos SYBR Green TaqMan/FRET Molecular Becons LUX Scorpions outros
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Vantagens Rápida ciclagem Alto Throughput Baixo risco de contaminação
Muito sensível Larga faixa dinâmica Reprodutibilidade Quantificável Não é mais caro que PCR convencional
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PCR
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Química da fluorescência
TaqMan SYBR Green
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TaqMan Atividade 5’-Nuclease
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Atividade da Taq Taq 5’ nuclease Síntese Nucleotídeo 5’ 3’
Direção da síntese
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A Atividade 5’-Nuclease não altera a PCR
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Fluorescent Resonant Energy Transfer
TaqMan utiliza FRET Fluorescent Resonant Energy Transfer
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TaqMan usa uma Probe Fluorescente
Reporter Quencher
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Taq Extende do Primer Upstream
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A atividade 5’-Nuclease digere a Probe
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Aumento do sinal do Reporter durante a Amplificação
Número de ciclos
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SYBR Green I Corante Minor Groove Binding. Sem probe; Custo mais baixo
que TaqMan Menos que 0.5g de DNA na amostra. Não aceita multiplex.
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Especificidade TaqMan Alta especificidade, inerente a química.
SYBR Green Baixa especificidade. Espec. observada apenas no “Melt Curve”
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PCR quantitativo Expressão gênica transgênicos Quant. Câncer
Qt patógenos
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Fases da PCR Plateau Linear Gel EtBr Log [DNA] Geométrica # ciclos
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Fase geométrica y = 2X
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Problemas nas fases linear e plateau
Fase linear Efeito Plateau
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PCR Qt tradicionais . . . . . Uso de competidores
Compartilha mesmos primers. Competidor = tamanhos diferentes. Compartilhar mesmas condições. Métodos radio / ELISA. . Gráfico conc. . . Limite de número de ciclos. . .
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São evitadas as fases linear e plateau.
O Que faz o Real Time? A tecnologia Real Time tem acesso a fase Geométrica maior qualidade. São evitadas as fases linear e plateau.
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Calibração externa DNA/RNA são amplificados como uma curva
separada para compensar a eficiência e fornecer unidades de quantificação target A Detection threshold target B Log [DNA] # ciclos
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Características do gráfico Real Time
Log [DNA] Cycle # Plateau Y=X(1+e)n Geometric Y=X2n Real-Time PCR Características do gráfico Real Time 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 5 10 15 20 25 30 35 40 Número de ciclos PCR Baseline Threshold C T Controle sem Template Amostra Fluorescência Normalizadada ”reporter” (Rn) Fase geométrica Alta CV baixa CV Rn CT é inversamente proporcinal a conc. de DNA
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Plot da Amplificação
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Curva Padrão y= -3.6x + 39 R2= 7 pg DNA 700 ng DNA
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OBRIGADO
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