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Biomarcadorese Doenças Neuro- degenerativas Joana(s) Tenente Fernandes Silva Braga Alfaiate Laranjinha Fragoso Maciel Universidade de Coimbra Faculdade.

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1 Biomarcadorese Doenças Neuro- degenerativas Joana(s) Tenente Fernandes Silva Braga Alfaiate Laranjinha Fragoso Maciel Universidade de Coimbra Faculdade de Medicina BioQuímica II Seminário Orientado n.º 2 10 de Março de 2010

2 Explicar o que são biomarcadores Analisar outros biomarcadores no plasma e/ou LCR em doenças neurodegenerativas Identificar essas proteínas no contexto bioquímico e funcional da célula Analisar e discutir os métodos de detecção Relacionar a análise da proteína com o diagnóstico das doenças humanas por priões Objectivos

3 Explicar o que são biomarcadores Analisar outros biomarcadores no plasma e/ou LCR em doenças neurodegenerativas Identificar essas proteínas no contexto bioquímico e funcional da célula Analisar e discutir os métodos de detecção Relacionar a análise da proteína com o diagnóstico das doenças humanas por priões

4 O que são biomarcadores? Indicadores usados como meio de medição dos processos biológicos normais, dos processos patológicos ou das respostas do organismo. Indicadores usados como meio de medição dos processos biológicos normais, dos processos patológicos ou das respostas do organismo. três tipos Podem ser classificados em três tipos: de exposição; de efeito; de susceptibilidade. Fácil acesso para análise; Fácil acesso para análise; Tem que ser possível medi-los e avaliá-los objectivamente. Tem que ser possível medi-los e avaliá-los objectivamente.

5 Explicar o que são biomarcadores Analisar outros biomarcadores no plasma e/ou LCR em doenças neurodegenerativas Identificar essas proteínas no contexto bioquímico e funcional da célula 4. Analisar e discutir os métodos de detecção 5. Relacionar a análise da proteína com o diagnóstico das doenças humanas por priões

6 Forma-se a partir da APP Proteína transmembranar que se encontra em grandes concentrações ao nível das sinapses Pode ser processada por 3 tipos de secretases: α β γ Mais amiloidogénica Através desta proteólise formam-se isoformas de Aβcom 39 a 42aminoácidos. Formação de Placas Senis Doença de Alzheimer Causas Genéticas Mutação cromossoma 19 – gene APOE4 Mutação cromossoma 21 – gene APP

7 Hipótese da Cascata da β-Amilóide Aumento e acumulação da Aβ42 Oligomerização e formação de proto- fibrilhas mutação Placas Senis (acumulam-se extracelularmente) Disfunção sináptica Stress oxidativo Alterações Homeastasia Iónica Mutações na Tau Também se verifica diminuição de neurotransmissores Morte do neurónio Demência

8 MAP presente principalmente na parte distal do axónio conferindo-lhe uma certa flexibilidade. Tem seis isoformasque resultam de splicing alternativo Distinguem-se pelo nº de locais de ligação O terminal carboxilo (positivo) interage com os microtúbulos(negativos) Regulação por fosforilação(ex PKN) Quando fosfoforilada torna-se inactiva, não há crescimento dos microtúbulos. Hiperfosfoforilação Misfolding - proteínas Tau ficam insolúveis leva a formação de depósitos Tranças neurofibrihares – destabilização dos microtúbulos.

9 Doença de Alzheimer Placas senis Placas senis - maior acumulação extracelular do peptídeobeta amilóide (Aβ). Doença neurodegenerativa com progressiva perda da memória e deterioração das funções cognitivas Doença neurodegenerativa com progressiva perda da memória e deterioração das funções cognitivas Duas formas clínicas: Duas formas clínicas: familiar familiar esporádica esporádica peptídeobeta-amilóide proteína Tau Pesquisa de biomarcadores para o diagnóstico precoce da DA. Aqueles com maior potencial de aplicação clínica no futuro próximo, determinados no LCR, são o peptídeobeta-amilóide e a proteína Tau. extracelulares Tranças neurofibrilhares Tranças neurofibrilhares - (mutações) hiperfosforilação da proteína tau, no interior dos microtúbulos do citoesqueleto dos neurónios. intracelulares Caracteriza-se pela existência simultânea de alterações: Caracteriza-se pela existência simultânea de alterações: Afecta, hoje em dia, milhões de pessoas em todo o Mundo.

10 Proteína com capacidade reguladora. Ligam-se a diferentes sinalizadores celulares. Cinases Fosfatases Receptores transmembra nares Os locais de ligação desta proteína têm normalmente uma serina fosforilada. A ligação ocorre ao nível da bindinggrooveque tem características anfipaticas Exemplo de local de ligação da na PKA Existe em grandes quantidades no LCR de alguns doentes

11 Surge no líquido cefalo-raquidiano quando há degeneração neuronal Surge no líquido cefalo-raquidiano quando há degeneração neuronal Estrita relação com doenças espongiformes Níveis altos de proteína no LCR Doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ) Diagnóstico Encefalopatia espongiforme subaguda transmissível mais frequente nos humanos Caracterizada por uma demência de progressão rápida Proteína importante biomarcador

12 Proteína encontrada no tecido neuronal Proteína encontrada no tecido neuronal Expressa-se no neocórtex, hipocampo, substância nigra, tálamo e cerebelo Expressa-se no neocórtex, hipocampo, substância nigra, tálamo e cerebelo Codificada pelo gene SNCA Codificada pelo gene SNCA Níveis altos de α-sinucleína Acumulação da proteína nos corpos de Lewy dos neurónios Doença de Parkinson importante biomarcador Proteína α-Sinucleína Alterações na estrutura da sinucleína para folha β parecem estar na origem da formação de agregados. Uma proteína que, tal como as outras sinucleínas, tem função desconhecida.

13 Poderá ser um biomarcador? Poderá ser um biomarcador? Sim Sim, porque… Grupos familiares com doença de Parkinson do tipo familiar, apresentam mutação no gene desta proteína É um dos principais constituintes dos corpos de Lewis Não Não, porque… Difícil acesso para análise Esta mutação não é a única causa da doença de Parkinson familiar, sendo possível desenvolver esta doença sem apresentar a mutação na alfa- sinucleína O caso da alfa-sinucleína

14 Explicar o que são biomarcadores Analisar outros biomarcadores no plasma e/ou LCR em doenças neurodegenerativas Identificar essas proteínas no contexto bioquímico e funcional da célula Analisar e discutir os métodos de detecção Relacionar a análise da proteína com o diagnóstico das doenças humanas por priões

15 Ambas são detectadas no LCR através da técnica de citometria de fluxo. Ambas são detectadas no LCR através da técnica de citometria de fluxo. Permite: Contar Analisar Classificar Como? Através de um citómetro de fluxo Proteína Tau e Proteína β-Amilóide

16 É detectada no LCR através do método de Western blot, que consiste: É detectada no LCR através do método de Western blot, que consiste: 1º Electroforese em gel As proteínas da amostra são separadas de acordo com o peso molecular 2º Transferência Passagem das proteínas do gel para uma membrana mantendo a mesma disposição que continham no gel 3º Bloqueio Passos necessários para impedir as interacções entre a membrana e o anticorpo usado para a detecção da proteína alvo 4º Detecção Usando um anticorpo especifico para a proteína de interesse, detecta-se a proteína em estudo 5º Análise detecção das sondas marcadas e ligadas à proteína de interesse através da Quimioluminescência Proteína

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18 Proteína : Proteína : É um meio complementar de diagnóstico É um meio complementar de diagnóstico Não tem especificidade fora do contexto do caso clínico Não tem especificidade fora do contexto do caso clínico Podem surgir falsos positivos em casos de meningoencefalites virais e AVC Podem surgir falsos positivos em casos de meningoencefalites virais e AVC Eficiência no diagnóstico Proteína tau e β-Amilóide: Proteína tau e β-Amilóide: São pouco específicos, podendo apresentar valores alterados sem que exista doença neurodegenerativas São pouco específicos, podendo apresentar valores alterados sem que exista doença neurodegenerativas

19 Explicar o que são biomarcadores Analisar outros biomarcadores no plasma e/ou LCR em doenças neurodegenerativas Identificar essas proteínas no contexto bioquímico e funcional da célula Analisar e discutir os métodos de detecção Relacionar a análise da proteína com o diagnóstico das doenças humanas por priões

20 Doenças por prião O prião (prion, proteinaceous infectious particle) é uma forma anormal de uma proteína estrutural que existe nas nossas células cerebrais; é insolúvel e resistente às proteases. O prião (prion, proteinaceous infectious particle) é uma forma anormal de uma proteína estrutural que existe nas nossas células cerebrais; é insolúvel e resistente às proteases. O problema gera-se porque basta um prião apenas para converter as proteínas funcionais em priões também. O problema gera-se porque basta um prião apenas para converter as proteínas funcionais em priões também. O prião é, então, a mais pequena partícula infectante conhecida, sendo considerado um agente etiológico de uma série de doenças neurodegenerativas, as DOENÇAS POR PRIÃO O prião é, então, a mais pequena partícula infectante conhecida, sendo considerado um agente etiológico de uma série de doenças neurodegenerativas, as DOENÇAS POR PRIÃO

21 Há várias doenças por prião: Há várias doenças por prião: Doença de Creutzfeld-Jakob (também conhecida por doença das vacas loucas) Doença de Creutzfeld-Jakob (também conhecida por doença das vacas loucas) Kuru Kuru Síndrome de Gerstmann-Straussen Síndrome de Gerstmann-Straussen Outros tipos de encefalopatias espongiformes Outros tipos de encefalopatias espongiformes Existem diversas variantes da CJD. Dentro da variante esporádica, existem diferentes estados de diagnóstico: o diagnóstico só é definitivo se for feito um exame neuropatológico do SNC que é feito na autópsia, apesar de poder ser feito por biopsia, o que é desaconselhado. Tal facto significa que, à partida, os diagnósticos feito em vida são prováveis ou possíveis. o diagnóstico só é definitivo se for feito um exame neuropatológico do SNC que é feito na autópsia, apesar de poder ser feito por biopsia, o que é desaconselhado. Tal facto significa que, à partida, os diagnósticos feito em vida são prováveis ou possíveis.

22 Possível Demência de progressão rápida (menos de 2 anos) 2 destas características (mioclonias, alterações visuais ou piramidais, ataxia cerebelosa, mutismo acinético) Provável Demência de progressão rápida (menos de 2 anos) 2 destas características (mioclonias, alterações visuais ou piramidais,ataxia cerebelosa, mutismo acinético) Proteína no LCR ou EEG típico Definitivo Exame neuropatológico do cérebro na autópsia ou biopsia

23 É urgente encontrar um marcador biológico específico para a doença. É urgente encontrar um marcador biológico específico para a doença. Foi demonstrado que as proteínas estão presentes no LCR de indivíduos com sCJD. Foi demonstrado que as proteínas estão presentes no LCR de indivíduos com sCJD. No entanto, é descrita a presença desta proteína noutras doenças, daí a necessidade de realizar exames complementares. No entanto, é descrita a presença desta proteína noutras doenças, daí a necessidade de realizar exames complementares. Importante biomarcador no LCR, quando há degradação neuronal; A presença desta proteína neste fluido está relacionada com encefalopatias espongiformes, que se caracterizam pela rápida degeneração neuronal criando-se autênticos buracos no cérebro. Proteína no diagnóstico Na Doença de Creutzfeldt-Jakob... Auxiliar de diagnóstico (através de punções lombares), quando incluída num contexto clínico apropriado.

24 Quanto mais punções lombares forem feitas, com intervalos de tempo entre elas, maiores são as hipóteses do diagnóstico ser realmente fiável. Quanto mais punções lombares forem feitas, com intervalos de tempo entre elas, maiores são as hipóteses do diagnóstico ser realmente fiável. Não há, infelizmente, um tempo preciso de intervalo entre elas para que o teste da proteína seja mais fiável. Não há, infelizmente, um tempo preciso de intervalo entre elas para que o teste da proteína seja mais fiável. Até porque se esta for feita muito no início, a doença pode não ter uma lesão neuronal muito vasta, não acusando ainda grandes níveis da proteína no LCR Até porque se esta for feita muito no início, a doença pode não ter uma lesão neuronal muito vasta, não acusando ainda grandes níveis da proteína no LCR A presença da proteína no LCR é então um importante auxiliar de diagnóstico da Doença de Creutzfeld-Jakob, na sua variante esporádica A presença da proteína no LCR é então um importante auxiliar de diagnóstico da Doença de Creutzfeld-Jakob, na sua variante esporádica

25 É importante diagnosticar estas doenças, pois elas hoje podem ser fatais e sem tratamento, mas quem sabe se um dia não o encontraremos? BiomarcadorDoençaNeurodegenerativ a Alzheimer Creutzfeldt-Jakob Parkinson

26 neuronios-de-recem-nascidos/ neuronios-de-recem-nascidos/ neuronios-de-recem-nascidos/ neuronios-de-recem-nascidos/ Artigos Artigos ReferênciasBibliográficas

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