BioQuímica II  Seminário Orientado n.º 2

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1 BioQuímica II  Seminário Orientado n.º 2
Universidade de Coimbra Faculdade de Medicina BioQuímica II  Seminário Orientado n.º 2 10 de Março de 2010 Biomarcadorese Doenças Neuro-degenerativas Joana(s) Tenente  Fernandes  Silva  Braga  Alfaiate  Laranjinha  Fragoso  Maciel

2 Objectivos 1. Explicar o que são biomarcadores Analisar outros biomarcadores no plasma e/ou LCR em doenças neurodegenerativas Identificar essas proteínas no contexto bioquímico e funcional da célula Analisar e discutir os métodos de detecção Relacionar a análise da proteína com o diagnóstico das doenças humanas por priões 2. 3. 4. “Por considerarmos que ao separarmos o segundo do terceiro objectivo haveria uma repetição de informação, pensámos que faria mais sentido juntá-los aqui na apresentação, uma vez que estes dois objectivos estão muito interligados.” 5.

3 1. 2. 3. 4. 5. Explicar o que são biomarcadores
Analisar outros biomarcadores no plasma e/ou LCR em doenças neurodegenerativas Identificar essas proteínas no contexto bioquímico e funcional da célula Analisar e discutir os métodos de detecção Relacionar a análise da proteína com o diagnóstico das doenças humanas por priões 2. 3. 4. 5.

4 O que são biomarcadores?
Indicadores usados como meio de medição dos processos biológicos normais, dos processos patológicos ou das respostas do organismo. Podem ser classificados em três tipos: de exposição; de efeito; de susceptibilidade. Fácil acesso para análise; Tem que ser possível medi-los e avaliá-los objectivamente.

5 1. 2. 3. 4. 5. Explicar o que são biomarcadores
Analisar outros biomarcadores no plasma e/ou LCR em doenças neurodegenerativas Identificar essas proteínas no contexto bioquímico e funcional da célula 4. Analisar e discutir os métodos de detecção 5. Relacionar a análise da proteína com o diagnóstico das doenças humanas por priões 2. 3. 4. 5.

6 β-Amilóide α β γ Pode ser processada por 3 tipos de secretases:
Forma-se a partir da APP Proteína transmembranar que se encontra em grandes concentrações ao nível das sinapses Formação de Placas Senis Doença de Alzheimer Através desta proteólise formam-se isoformas de Aβcom 39 a 42aminoácidos. Pode ser processada por 3 tipos de secretases: α β γ APP –amyloid precursor protein Beta Amilóide Aβ Forma-se a partir da APP (amyloid precursor protein). É uma glicoproteínatransmembranar, e pensa-se que a sua função está relacionada com a regulação ou formação de sinapses, uma vez que se encontra em grandes concentrações ao nível das sinpases. A APP pode ser processada através de três secretases: α-, β- e γ-secretases. A alfa e beta secretases clivam a APP na parte extracelular enquanto que a gama cliva na parte transmembranar. A β secretase é aquela que é mais amiloidogénica, pois produz (depois da clivagem pela γ secretase) resíduos maiores com a capacidade de formar as fibrilhas. É através desta proteólise que se originam os peptídios (isoformas) de Aβ. Estes peptídios tem entre 39 e 42 AA.  As isoformas mais comuns de Aβ são a Aβ40 e Aβ42, sendo que a última é a mais fibrilhogénica tendo por isso uma maior relação/ incidência na doença de Alzheimer Mais amiloidogénica Causas Genéticas Mutação cromossoma 19 – gene APOE4 Mutação cromossoma 21 – gene APP

7 Resposta Inflamatória
Hipótese da Cascata da β-Amilóide mutação Placas Senis (acumulam-se extracelularmente) Aumento e acumulação da Aβ42 Oligomerização e formação de proto-fibrilhas Resposta Inflamatória Disfunção sináptica Stress oxidativo Alterações Homeastasia Iónica Mutações na Tau Morte do neurónio Demência Também se verifica diminuição de neurotransmissores

8 Proteína Tau Regulação por fosforilação(ex PKN) Hiperfosfoforilação
MAP presente principalmente na parte distal do axónio conferindo-lhe uma certa flexibilidade. Distinguem-se pelo nº de locais de ligação Tem seis isoformasque resultam de splicing alternativo O terminal carboxilo (positivo) interage com os microtúbulos(negativos) Quando fosfoforilada torna-se inactiva, não há crescimento dos microtúbulos. Regulação por fosforilação(ex PKN) Hiperfosfoforilação Misfolding - proteínas Tau ficam insolúveis leva a formação de depósitos Proteína Tau A Tau é uma MAP (microtubuleassociatedprotein). tem como função estabilizar os microtúbulos e encontra-se principalmente nos neurónios. A tau associa-se à tubulina estabilizando os microtubulos e favorecendo o crescimento destes. A principal função da tau nos neurónios é estabilizar os microtúbulos no axónio (principalmente na sua parte distal), conferindo-lhe também uma certa flexibilidade. A tau não está presente nas dendrites. Existem seis isoformas de tau no tecido cerebral que se distinguem pelo número de domínios de ligação. Estes locais de ligação encontram-se no terminal carboxilo da proteína e são positivamente carregados o que permite q estes interajam com os microtubulos que são negativamente carregados. Três isoformas tem 3 locais de ligação enquanto q as restantes tem quatro. As últimas são mais eficientes na estabilização de microtúbulos. As isoformas resultam do splicing alternativo dos exões 2,3 e 10 do gene da Tau. A tau pode ser regulada por fosforilação. Esta fosforilação ocorre por diferentes cinases, entre as quais a PKN, uma cinase de serina/treonina. Uma vez fosforilada a tau torna-se inactiva e por isso não há crescimento de microtubulos. No seu estado ‘natural’ a tau é uma proteína solúvel, no entanto se ocorrer uma hiperfosforilação esta pode formar depósitos – tranças neurofibrilhares – como se verifica na doença de Alzheimer. Consequentemente ocorre uma destabilização dos microtúblos. A principal função da tau nos neurónios é estabilizar os microtúbulos no axónio (principalmente na sua parte distal), conferindo-lhe também uma certa flexibilidade. A tau não está presente nas dendrites. imagem : Nota sobre as isoformas da tau: The tau gene locates on chromosome 17q21, containing 16 exons. The major tau protein in the human brain is encoded by 11 exons. Exon 2, 3 and 10 are alternative spliced, allowing six combinations ( ; ; ; ; ; ). Thus, in the human brain, the tau proteins constitute a family of six isoforms with the range from amino acids. They differ in either no, one or two inserts of 29 amino acids at the N-terminal part (exon 2 and 3), and three or four repeat-regions at the C-terminal part exon 10 missing. So, the longest isoform in the CNS has four repeats (R1, R2, R3 and R4) and two inserts (441 amino acids total), while the shortest isoform has three repeats (R1, R3 and R4) and no insert (352 amino acids total). All of the six tau isoforms are present in an often hyperphosphorylated state in paired helical filaments from Alzheimer's Disease brain. Inotherneurodegenerativediseases, thedepositionofaggregatesenrichedincertain tau isoformshasbeenreported. Whenmisfoldedthisotherwiseverysolubleproteincanformextremelyinsolubleaggregatesthatcontribute to a numberofneurodegenerativediseases. Tranças neurofibrihares – destabilização dos microtúbulos.

9 Doença de Alzheimer Afecta, hoje em dia, milhões de pessoas em todo o Mundo. Doença neurodegenerativa com progressiva perda da memória e deterioração das funções cognitivas Duas formas clínicas: familiar esporádica Caracteriza-se pela existência simultânea de alterações: Tranças neurofibrilhares - (mutações) hiperfosforilação da proteína tau, no interior dos microtúbulos do citoesqueleto dos neurónios. intracelulares “Vamos começar por relacionar cada uma das doenças com as diferentes proteínas e depois falar acerca de cada um destes biomarcadores em mais profundidade.” “Encontra-se neste slide uma pequena explicação do que é a doença de Alzheimer e a sua relação com os biomarcadores que lhe estão associados.” Placas senis - maior acumulação extracelular do peptídeobeta amilóide (Aβ). extracelulares Pesquisa de biomarcadores para o diagnóstico precoce da DA. Aqueles com maior potencial de aplicação clínica no futuro próximo, determinados no LCR, são o peptídeobeta-amilóide e a proteína Tau.

10 Existe em grandes quantidades no LCR de alguns doentes
Proteína Cinases Fosfatases Receptores transmembranares Proteína com capacidade reguladora. Ligam-se a diferentes sinalizadores celulares. A ligação ocorre ao nível da bindinggrooveque tem características anfipaticas Os locais de ligação desta proteína têm normalmente uma serina fosforilada. Existe em grandes quantidades no LCR de alguns doentes LCR – liquidocefalo raquidiano CJD - Creutzfeldt-Jakobdisease Proteína Proteínas com propriedades reguladoras com capacidade de se ligarem a vários sinalizadores celulares: cinases, fosfatases ou receptores transmembranares. Exemplos de locais de ligação da , a esqerda na PKA a à direita ao nível de um receptor de insulina. Os locais de ligação da têm normalmente uma serina fosforilada ou um resíduo de treonina. A ligação ocorre ao nível da ‘bindinggroove’ que tem características anfipáticas. Nota: proteins mainly bind proteins containing phosphothreonine or phosphoserine motifs however exceptions to this rule do exist. Extensive investigation of the binding site of the mammalian serine/threoninekinase Raf-1 has produced a consensus sequence for binding, RSxpSxP (in the single-letter amino-acid code, where x denotes any amino acid and p indicates that the next residue is phosphorylated) proteins appear to effect intracellular signalling in one of three ways - by direct regulation of the catalytic activity of the bound protein, by regulating interactions between the bound protein and other molecules in the cell by sequestration or modification or by controlling the subcellularlocalisation of the bound ligand. Proteins appear to initially bind to a single dominant site and then subsequently to many, much weaker secondary interaction sites. The dimer is capable of changing the conformation of its bound ligand whilst itself undergoing minimal structural alteration. In Esta proteina é encontrada em grandes concentrações no liquido cefalo raquidiano de doentes com a CJD (Creutzfeldt-Jakobdisease) Exemplo de local de ligação da na PKA

11 Proteína Surge no líquido cefalo-raquidiano quando há degeneração neuronal Estrita relação com doenças espongiformes Níveis altos de proteína no LCR Diagnóstico Doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ) Encefalopatia espongiforme subaguda transmissível mais frequente nos humanos Caracterizada por uma demência de progressão rápida importante biomarcador

12 Proteína α-Sinucleína
Uma proteína que, tal como as outras sinucleínas, tem função desconhecida. Proteína encontrada no tecido neuronal Expressa-se no neocórtex, hipocampo, substância nigra, tálamo e cerebelo Codificada pelo gene SNCA Níveis altos de α-sinucleína Acumulação da proteína nos corpos de Lewy dos neurónios Alterações na estrutura da sinucleína para folha β parecem estar na origem da formação de agregados. Doença de Parkinson importante biomarcador

13 O caso da alfa-sinucleína
Poderá ser um biomarcador? Sim, porque… Grupos familiares com doença de Parkinson do tipo familiar, apresentam mutação no gene desta proteína É um dos principais constituintes dos corpos de Lewis Não, porque… Difícil acesso para análise Esta mutação não é a única causa da doença de Parkinson familiar, sendo possível desenvolver esta doença sem apresentar a mutação na alfa-sinucleína

14 1. 2. 3. 4. 5. Explicar o que são biomarcadores
Analisar outros biomarcadores no plasma e/ou LCR em doenças neurodegenerativas Identificar essas proteínas no contexto bioquímico e funcional da célula Analisar e discutir os métodos de detecção Relacionar a análise da proteína com o diagnóstico das doenças humanas por priões 2. 3. 4. 5.

15 Proteína Tau e Proteína β-Amilóide
Ambas são detectadas no LCR através da técnica de citometria de fluxo. Permite: Contar Analisar Classificar Como? Através de um citómetro de fluxo

16 Proteína É detectada no LCR através do método de Western blot, que consiste: 1º Electroforese em gel As proteínas da amostra são separadas de acordo com o peso molecular 2º Transferência Passagem das proteínas do gel para uma membrana mantendo a mesma disposição que continham no gel 3º Bloqueio Passos necessários para impedir as interacções entre a membrana e o anticorpo usado para a detecção da proteína alvo 4º Detecção Usando um anticorpo especifico para a proteína de interesse, detecta-se a proteína em estudo 5º Análise detecção das sondas marcadas e ligadas à proteína de interesse através da Quimioluminescência

17 Este slide é passado só para eles terem uma noção esquemática do western blot. Não é preciso perderes muito tempo com ele...

18 Eficiência no diagnóstico
Proteína : É um meio complementar de diagnóstico Não tem especificidade fora do contexto do caso clínico Podem surgir falsos positivos em casos de meningoencefalites virais e AVC Proteína tau e β-Amilóide: São pouco específicos, podendo apresentar valores alterados sem que exista doença neurodegenerativas

19 1. 2. 3. 4. 5. Explicar o que são biomarcadores
Analisar outros biomarcadores no plasma e/ou LCR em doenças neurodegenerativas Identificar essas proteínas no contexto bioquímico e funcional da célula Analisar e discutir os métodos de detecção Relacionar a análise da proteína com o diagnóstico das doenças humanas por priões 2. 3. 4. 5.

20 Doenças por prião O prião (prion, proteinaceous infectious particle) é uma forma anormal de uma proteína estrutural que existe nas nossas células cerebrais; é insolúvel e resistente às proteases. O problema gera-se porque basta um prião apenas para converter as proteínas funcionais em priões também. O prião é, então, a mais pequena partícula infectante conhecida, sendo considerado um agente etiológico de uma série de doenças neurodegenerativas, as DOENÇAS POR PRIÃO

21 Há várias doenças por prião:
Doença de Creutzfeld-Jakob (também conhecida por “doença das vacas loucas”) Kuru Síndrome de Gerstmann-Straussen Outros tipos de encefalopatias espongiformes Existem diversas variantes da CJD. Dentro da variante esporádica, existem diferentes estados de diagnóstico: o diagnóstico só é definitivo se for feito um exame neuropatológico do SNC que é feito na autópsia, apesar de poder ser feito por biopsia, o que é desaconselhado. Tal facto significa que, à partida, os diagnósticos feito em vida são prováveis ou possíveis.

22 Possível Provável Definitivo
Demência de progressão rápida (menos de 2 anos) 2 destas características (mioclonias, alterações visuais ou piramidais, ataxia cerebelosa, mutismo acinético) Provável 2 destas características (mioclonias, alterações visuais ou piramidais,ataxia cerebelosa, mutismo acinético) Proteína no LCR ou EEG típico Definitivo Exame neuropatológico do cérebro na autópsia ou biopsia Tem na folha de texto mais explicado o que é cada um. Acho que não vale a pena por aqui

23 Proteína 14-3-3 no diagnóstico
Importante biomarcador no LCR, quando há degradação neuronal; A presença desta proteína neste fluido está relacionada com encefalopatias espongiformes, que se caracterizam pela rápida degeneração neuronal criando-se autênticos “buracos no cérebro”. Na Doença de Creutzfeldt-Jakob... É urgente encontrar um marcador biológico específico para a doença. Foi demonstrado que as proteínas estão presentes no LCR de indivíduos com sCJD. No entanto, é descrita a presença desta proteína noutras doenças, daí a necessidade de realizar exames complementares. Auxiliar de diagnóstico (através de punções lombares), quando incluída num contexto clínico apropriado.

24 Quanto mais punções lombares forem feitas, com intervalos de tempo entre elas, maiores são as hipóteses do diagnóstico ser realmente fiável. Não há, infelizmente, um tempo preciso de intervalo entre elas para que o teste da proteína seja mais fiável. Até porque se esta for feita muito no início, a doença pode não ter uma lesão neuronal muito vasta, não acusando ainda grandes níveis da proteína no LCR A presença da proteína no LCR é então um importante auxiliar de diagnóstico da Doença de Creutzfeld-Jakob, na sua variante esporádica

25 Proteína α-Sinucleína
Biomarcador DoençaNeurodegenerativa Proteína Tau Alzheimer Proteína β-Amilóide Proteína Creutzfeldt-Jakob Proteína α-Sinucleína Parkinson É importante diagnosticar estas doenças, pois elas hoje podem ser fatais e sem tratamento, mas quem sabe se um dia não o encontraremos?

26 ReferênciasBibliográficas
Artigos

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