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Bruna de Carvalho Sorrentino Tiago Henriques Moreira Fisiologia Renal 3º período – Medicina Universidade Federal do Rio de Janeiro Macaé, 25 de Julho de.

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1 Bruna de Carvalho Sorrentino Tiago Henriques Moreira Fisiologia Renal 3º período – Medicina Universidade Federal do Rio de Janeiro Macaé, 25 de Julho de 2012

2 Sat1: Transportador de ânion sulfato 1; Também denominado Slc26a1; Localizado na membrana basolateral dos rins e segmentos distais do intestino (íleo distal, ceco e cólon proximal); e na membrana sinusóide dos hepatócitos; Medeia o transporte epitelial de oxalato e sulfato; Importante papel na homeostase do oxalato e sulfato. O gene do Sat 1 está localizado no Exon 2/ Íntron 2 do gene da alfa-L- iduronidase (IDUA).

3 Urolitíase: O oxalato de cálcio, produto da excreção urinária, pode formar cristais que ao se agregarem podem formar cálculos renais no sistema urinário. Hepatotoxicidade: O sulfato é essencial para a fase II da detoxificação no fígado, e é altamente reabsorvido pelos rins.

4 Objetivo principal do estudo: Determinar as funções fisiológicas do transportador Sat1 na regulação da homeostase do oxalato e do sulfato.

5 Métodos e Resultados:

6 1. Construção do vetor alvo: Fragmentos de Sat 1 foram multiplicados por PCR para se criar o fragmento alvo. A estratégia utilizada para a criação do fragmento alvo consiste da troca do Exon 3 por um cassete de resistência à Neomicina.

7 2. Criação e identificação de camundongos Sat1-/- : O fragmento alvo é eletroporado para células embrioblásticas de camundongo; Células embrioblásticas positivas são injetadas em blastócitos CD1, que são implantados na fêmea receptora; Camundongos quiméricos foram cruzados com heterozigóticos, a fim de produzir camundongos Sat1-/-.

8 3. Determinação do genótipo dos camundongos: O fragmento do alelo recombinante de Sat 1 foi amplificado por PCR, a fim de se obter o genótipo dos camundongos; O transportador Sat 1, nos camundongos Sat1-/-, encontra-se ausente nas vesículas da membrana basolateral dos rins, fígado, íleo distal, ceco, cólon proximal.

9 4. Análise do RNA: RNA total é separado em gel em estado tampão, e transferido para membranas de nylon. Os borrões formados são injetados com cDNA de Sat1; RNA total foi transcrito reversamente usando hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa virótica (Progen); Primer P8 (exon 2) e P9 antisense (exon 4) foram usados para amplificar os fragmentos de cDNA Sat1;

10 5. Preparação da vesícula de membrana e estudos de transporte: Vesículas de membrana basolateral (BLMVs) e da borda em escova (BBMVs) foram isoladas do rim, fígado e intestino, e pré-incubadas em solução tampão; A absorção de sulfato e oxalato foi medida pela técnica de filtração rápida; Proteínas da BLMV foram separadas em gel e transferidas para a membrana de nylon; Protéínas Sat1 foram detectadas usando anticorpos para Sat1.

11 Sat1-/- : Diminuição no transporte de oxalato e sulfato na membrana basolateral dos rins, fígado, íleo distal, ceco e cólon proximal.

12 6. Análise bioquímica: Sangue: coletado da veia submandibular; Urina: coletada por micção espontânea prévia à coleta de sangue; HCl foi adicionado a amostras de plasma e urina; as amostras foram congeladas para evitar a precipitação de oxalato e oxalogênese. Os níveis de atividade do gene IDUA no rim e fígado foram avaliados; Foram medidos os níveis de: Sulfato; Oxalato; Creatinina; PO4-, Na+, K+, Cl-, Ca2+ plasmáticos; Glicolato urinário; Proteínas na urina; pH; H2O cecal;

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14 7. Análise histopatológica: Tecidos foram dissecados em ~ 50 volumes com 10% de tampão de formalina, fixados por 3 dias, e imersos em parafina; Tecidos foram seccionados, marcados para detecção de cristais de oxalato de cálcio, e examinados por microscopia de luz; Seções do fígado apresentaram degeneração e necrose severas.

15 Urolithiasis in Sat1–/– mice. (A and B) Representative H&E-stained kidney sections showing infiltration of leukocytes (arrow) around the renal cortical vessels in 100% of Sat1–/– mice (n = 8), absent in Sat1+/+ mice.(C–F) Representative Yasue-stained kidney (C and D) and bladder (E and F) sections showing calcium oxalate stones (dark staining) in kidney tubules of 47% Sat1–/– mice (n = 15) and bladders of 26% Sat1–/– mice (n = 19), but not in any Sat1+/+ mice (n = 10). Gross histological analyses of additional tissues in which Sat1 is expressed (liver and brain) showed no structural differences between Sat1–/– and Sat1+/+ mice (not shown). Scale bars: 100 ìm (A and B); 500 ìm (C and D); 2 mm (E and F).

16 8. Administração de APAP: Acetaminofeno (APAP) foi dissolvido em soro, filtrado e esterilizado; Com ~ 3 meses, os camundongos receberam injeção de APAP, morrendo entre 2 a 12 hs após administração.

17 (C and D) Representative H&E-stained liver sections of Sat1+/+ and Sat1–/– mice (n = 6–7 per group) 12 hours after administration of 250 mg/kg APAP, showing liver necrosis in Sat1–/– mice. Necrose hepática após administração de APAP:

18 Não aconteceram diferenças no peso corporal, tamanho do rabo ou outra característica corporal que distinguisse camundongos Sat1-/- dos Sat1+/- ou Sat1+/+. Porém, foram observadas diferenças histológicas; As veias corticais renais sofreram infiltração por leucócitos: sugestiva de obstrução ureteral ou uropatia obstrutiva; Cristais de oxalato foram observados nos túbulos corticais renais e na bexiga; Aumento da concentração plasmática do oxalato e diminuição da concentração do sulfato; Aumento do sulfato e diminuição do oxalato no conteúdo cecal. Nos camundongos Sat1-/- :

19 Sat1 e IDUA: Os genes Sat1 e IDUA são sobrepostos; Distorções seletivas no gene IDUA não levaram a alterações nos níveis de RNAm para Sat1; Ausência de mudanças na atividade funcional do IDUA em Sat1-/- sugere que efeitos antisense não atuem de forma relevante na regulação da expressão dos genes Sat1 e IDUA.

20 Sat1-/- e oxalato: Os níveis elevados de oxalato no plasma, aumento da razão oxalato/creatinina na urina, manutenção da razão glicolato/creatinina na urina (indicador da produção hepática de oxalato), e redução no transporte de oxalato na membrana basolateral de segmentos do intestino distal: SUGEREM QUE >

21 Hiperoxalúria e hiperoxalemia: A hiperoxalúria nos camundongos Sat1-/- é devido à hiperoxalemia, e não a alterações do oxalato nos túbulos renais.

22 Sat1-/- e sulfato: Diminuição significante do sulfato no soro, aumento da razão sulfato/creatinina na urina, e aumento no índice de excreção fracionada (FEI) de sulfato: SUGEREM QUE >

23 Hiposulfatemia: Ocorre provavelmente devido à elevada excreção renal de sulfato em camundongos Sat1-/-. Há grande redução do transporte de sulfato através da membrana basolateral renal e sinusoidal hepática, sugerindo que Sat1 é o transportador de sulfato predominante na membrana basolateral do túbulo proximal renal, e na membrana sinusoidal dos hepatócitos.

24 Sat1-/- e a hepatotoxicidade: O esgotamento de sulfato pela ausência de Sat1 nas membranas sinusoidais dos hepatócitos, onde facilitam o importe de sulfato para as reações de sulfonação, e a hiposulfatemia, acarretam em lesões hepáticas induzidas por fármacos como o APAP.

25 Referência bibliográfica: Dawson PA, Russell CS, Lee S, McLeay SC, Van Dongen JM, Cowley DM, Clarke LA, Markovich D. Urolithiasis and hepatotoxicity are linked to the anion transporter Sat1 in mice. J Clinical Investigation. 2010; 120 (3):


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