A apresentação está carregando. Por favor, espere

A apresentação está carregando. Por favor, espere

Design, síntese total e superexpressão funcional do gene lip1 de Candida rugosa codificando para uma grande lipase industrial Amanda F. Sarmento Nathani.

Apresentações semelhantes


Apresentação em tema: "Design, síntese total e superexpressão funcional do gene lip1 de Candida rugosa codificando para uma grande lipase industrial Amanda F. Sarmento Nathani."— Transcrição da apresentação:

1 Design, síntese total e superexpressão funcional do gene lip1 de Candida rugosa codificando para uma grande lipase industrial Amanda F. Sarmento Nathani C. B. Denardi Rafael L. Farinha Disciplina: Engenharia de proteínas Prof. Dr. Jesus A. Ferro Jaboticabal Setembro de 2013 S. BROCCA, C. SCHMIDT-DANNERT, M. LOTTI, L. ALBERGHINA and R. D. SCHMID, 1998

2 Design, síntese total e superexpressão funcional do gene lip1 de Candida rugosa codificando para uma grande lipase industrial Amanda F. Sarmento Nathani C. B. Denardi Rafael L. Farinha Disciplina: Engenharia de proteínas Prof. Dr. Jesus A. Ferro Jaboticabal Setembro de 2013 S. BROCCA, C. SCHMIDT-DANNERT, M. LOTTI, L. ALBERGHINA and R. D. SCHMID, 1998

3 Introdução Lipases As lipases (Triacilglicerol acil-hidrolases EC ) são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilglicerídeos na interface água/meio orgânico. In vitro são enzimas versáteis devido a sua capacidade de catalisar a hidrólise e a síntese de uma grande variedade de ésteres, ou a resolução de misturas racémicas De maneira geral, as lipases não requerem cofatores, atuam em ampla faixa de pH, são estáveis à altas temperaturas, que fazem com que sejam altamente aplicáveis em processos industriais (VILLENEUVE et al., 2000; HASAN, SHAH, HAMEED, 2006).

4 Muitos processos tecnológicos utilizam catalisadores biológicos nas sequências de conversão química. As principais fontes de obtenção de lipases para aplicação industrial têm sido os microorganismos. Tanto micro-organismos eucariotos (leveduras) como procariotos (bactérias), são produtores de lipases e suas propriedades variam de acordo com a procedência. O uso de enzimas nas indústrias possibilita o desenvolvimento de processos tecnológicos tão eficientes quanto aos realizados pela natureza (HASAN; SHAH; HAMEED, 2006) e sem causar riscos ambientais. Introdução

5 Algumas aplicações da lipase: -Indústrias de detergentes; -Medicamentos; -Alimentos (panificação, queijos e chás); -Têxteis; -Cosméticos; -Biodiesel; - Tratamento de efluentes; Introdução

6 Candida rugosa - Trata-se de uma levedura do gênero Candida sp. - As lipases de Candida rugosa estão entre as lipases comercias mais frequentemente utilizadas na hidrólise e a síntese de uma gama de ésteres de interesse comercial (Kotting & Eibl, 1994; Vulfson, 1994). - Na maioria das aplicações biocatalíticas preparações de enzima em bruto, obtidas com TCA (Ácido tricloroacético) do sobrenadante da cultura, são aplicadas.

7 - Uma alta homologia de sequência (entre 60-70%) entre vários genes de lipase que foram clonados a partir de C. rugosa. - Diferenças na glicolisação destas lipases podem contribuir para esta heterogeneidade. - Várias isoformas de lipase foram isoladas a partir de preparação de enzimas comerciais, sendo mostrado que o produto do gene lip1 é o constituinte principal. - Pelo fato das isoformas poderem diferir nos seus desempenhos catalíticos e suas propriedades poderem ainda ser afetadas pelos processos de purificação, pensou-se que a clonagem e expressão do gene lip1 seria a abordagem mais adequada para produção e caracterização de lipase pura de C. rugosa. Introdução

8 - C. rugosa dimórfica obedece a uma utilização de códons em que o não-canônico tripleto CUG, um códon universal para leucina, é lido com serina. - Na maioria das espécies de Candida sp., filogeneticamente relacionados, CUG é extremamente raro, com notável exceção de C. rugosa, onde responde por cerca de 40% do total de códons de serina. - No gene Lip1, 20 dos seus 47 resíduos de serina, incluindo a Ser 209 catalítica, são codificados por tripletos CUG. Como consequência, a expressão heteróloga de Lip1 em Saccharomyces cerevisiae resulta em uma lipase inativa. Introdução A troca de vários, ou mesmo a maioria, códons CUG por tripletos universais de serina (UCN, AGY) é necessária para expressão em hospedeiro heterólogo.

9 Neste trabalho foram investigadas duas abordagens para a expressão da proteína funcional de Lip1 : - Mutagênese de um gene Lip1 natural e a sua expressão em S. cerevisiae; - Síntese química enzimática do mesmo gene. Três genes sintéticos recombinantes (slip1) foram construídos diferindo na sequência líder. Os genes recombinantes foram expressos em S. cerevisiae e Picha pastoris. Introdução

10 Picha pastoris - É uma espécie de levedura metilotrófica. -Como em S. cerevisiae, a secreção pelas células requer a presença de uma sequência de sinal fundido com a proteína expressa. -Propriedades físico-químicas e catalíticas da lipase recombinante produzidas por P. pastoris, foram comparadas com as CRLs comercias, revelando que são idênticas.

11 Mutagênese sítio-dirigida do gene da lipase de C. rugosa Cinco membros, pertencentes à família de multigenes de codificação para as lipases de C. rugosa. Utilização da sequência Lip1 Melhor caracterizado; Estrutura cristalográfica resolvida; Codifica a principal isoforma da lipase; Lip1 contém sequência genômica com uma única ORF de 1647 pb, o que corresponde a uma proteína de 549 resíduos com uma extensão N-terminal de 15 resíduos hidrofóbicos, que codificam um peptídeo sinal.

12 A proteína madura Lip1 contém 46 resíduos de Serina, 19 delas codificadas por tripletos CTG. A primeira tentativa de superar os problemas que ocorrem na expressão heteróloga foi a substituição, por mutagênese sítio-dirigida dos códons CTG por outros códons universais para Serina. Hierarquia dos resíduos de Ser, funcionalmente e estruturalmente mais importante a ser mutado. Mutagênese sítio-dirigida do gene da lipase de C. rugosa

13 Mutantes de Serina Com base no alinhamento com outras Serinas-hidrolases e sobre a estrutura 3D da enzima são selecionadas oito Ser como alvo para mutagênese. - Quatro genes mutantes, contendo um Nº crescente de resíduos de Ser restaurados.

14 Mutagênese sítio-dirigida do gene da lipase de C. rugosa Genes mutantes foram clonados no vetor pEMBLyex4, contendo a sequência de indução. Células de leveduras recombinantes, cultivas sob condições de indução, acumulam intracelularmente produto inativo do gene Lip1 a um nível de 10-20mg/L da cultura. Embora a análise da glicolisação de proteínas recombinantes tenha fornecido evidências de N-glicolisação, como no caso de Lip1 do tipo selvagem, sua secreção falhou sugerindo dificuldades no nível pós-transcrional.

15 Construção de um material sintético, com códons optimizados da lipase da C. rugosa

16 Expressão da lipase recombinante em P. pastoris e S. cerevisiae nl-slip 1 Gene sintético PCR pp-slip 1p-slip 1 PCR Vetores pPICZαB pYES2 pY-nl-slip1 pY-pp-slip1 pY-p-slip1 pPIC-nl-slip1 pPIC-pp-slip1 pPIC-p-slip1 P. pastorisS. cerevisiae

17 Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris Pichia Pastoris e Metanol -> Fonte de Carbono AOX regula Metanol Secreção evidenciada por anéis nas placas de tributirina-metanol. pPIC-pp-slip1 e pPIC-p-slip1 -> Atividade Overnight pPIC-NL-slip1 ->Atividade (48h-72h) pPICZ-alfa-B -> Sem atividade

18 Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris Seleção dos melhores clones através da formação de anéis. Cultivo – Metanol 20mL (Fonte de Carbono) – Indução: 48h Palmitato de p-nitrofenil -> Sobrenadante (Multiplas Inserções Genômicas) Cultivo – BMMY 200 ml (Meio Rico Padrão) – Indução: 5dias

19 Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris Atividade da Lipase: – pPIC-p-slip1 – pPIC-pp-slip1 SDS-PAGE – Única Banda de 60 Kda – Peso molecular já era esperado para a Lip1 – Nenhuma outra proteína foi secretada pela P.Pastoris 85 U/ml

20

21 Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris Outros testes executados – Western-Blott – Sequênciamento Amino-Terminal Acúmulo de Lipase recombinante no meio Intracelular -> Seq. Pré-Pro Sinalizadora do Fator Alfa (pPIC-pp-slip1) -> Apenas Expressão Não houve acúmulo -> Seq. Sinalizadora Natural -> Apenas Secreção Seq. Líder sinaliza a secreção na P.pastoris, evitando o acúmulo. Seq. Pré-Sinalizadora do Fator Alfa (pPIC-p-slip1) -> Secreção E expressão

22 Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris Clone pPIC-pp-slip1 com o maior nível de secreção de lipase Fermentação com Biorreator BMMY pH 6 208h Para melhorar ainda... Fermentação Celular de Alta Densidade 280h 125 U/ml 150 U/ml

23

24 Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris Produtividade de U/L por hora. – Lipase Nativa na C.rugosa – Ácido Oleico X Metanol (Fonte de Carbono_ – Produção de 250 U/L por hora. – P.pastoris com lip1 tem o dobro da produtividade

25 Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em S.cerevisiae Transformantes obtidos por vetores: – pY-nl-slip1 – pY-pp-lip1 – pY-p-slip1 Atividade lipásica – Placas de Tributirina-Galactose – Indução: 24h – 30ºC Transformante obtido por vetor: – Pyes2 -> Não teve atividade

26 Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em S.cerevisiae Os melhores clones foram cultivados: – Erlenmeyes 2-L – 200mL meio de Glicose Mínimo – Até atingir Densidade Óptica 600 – 5 dias de indução -> Meio mínimo Galactose Atividade dos sobrenadantes: 5-7U/mL (vetores pY-pp-slip1, pY-p-slip1, pY-nl-slip1) – 12-17x menos efetivo que na P.pastoris em cultivo de pequena escala

27 Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em S.cerevisiae Para o gene natural e modificado -> Completa falha em relação a lipase – Sem Acúmulo – Sem Secreção

28 Caracterização da Lipase Recombinante Elétroforese de poliacrilamida do plasmídio pPIC-p-slip1 da P.pastoris -> Única banda de 60 kDA. – Lip1 Nativa e suas Isoformas A sequencia de aminoacidos da Lip1 contem três sítios potenciais de N-glicosilação nas posições 291, 314 e 351 Após a Deglicosilação: – Perda de 3kDa -> 5% do peso eram carboídratos – Nas Lipases não recombinantes, o peso é de cerca de 3,6-8% de carboídratos Realizada antes e depois da Desnaturação – Peso molecular igual

29 Caracterização da Lipase Recombinante C.rugosa comercial – Lip1 ativa em 30-40ºC – pH 7 (Efetividade reduzida em 60% se elevado a pH 8) – Dois pI pouco diferentes (3,9 e 4)

30

31 Caracterização da Lipase Recombinante Comparação da Especifidade de substratos entre lip1 e lipase da C.rugosa – Triglicerideos com variação em tamanho de cadeias de grupos acyl – Atividade Lipolítica Alta Tricaproina (C8) Tricaprina (C10) – Atividade Lipolítica Baixa Trioleina (C18) – Atividade HIDROlítica Alta Mantega de Cacau(C16-18)

32

33 Caracterização da Lipase Recombinante Comparação da Especifidade de substratos entre lip1 e lipase da C.rugosa – Ésteres Metílicos com variação em tamanho de cadeias de grupos acyl (C6-C22) – Após a atividade da lipase, os acidos graxos foram quantificados por Cromatografia em Gás – Atividade Lipolítica Alta C8 - C10 – Atividade Lipolítica NULA C18 – C22

34

35 Caracterização da Lipase Recombinante Comparação da Especifidade de substratos entre lip1 e lipase da C.rugosa – Ésteres Metílicos com variação em tamanho de cadeias de grupos acyl(C6-C22) – Após a atividade da lipase, os acidos graxos foram quantificados por Cromatografia em Gás – Atividade Lipolítica Alta C8 - C10 – Atividade Lipolítica NULA C18 – C22

36 Caracterização da Lipase Recombinante Propriedades físíco-quimicas e catalíticas da Lip1 e CRL coincidem Lip1 em P.pastoris -> Mais funcionalmente Ativa

37 Protocolo Experimental

38 Cepas, plasmídeos e meios E. coli: DH5a Plasmídeos: pUC19 e PCYTEXP1 PEMBLyex4 pYES (Invitrogen) pPICZαB (Invitrogen) hospedeiro para amplificação do plasmídeo P. pastoris GS115 (Invitrogen) S. cerevisiae INVSC2 (Invitrogen) S. cerevisae X4004.3A Expressão da lipase recombinante clonagem e xpressão

39 Cepas, plasmídeos e meios P. pastoris cultivada em frasco de agitação a 30ºC Meio rico padrão S. cerevisiae cultivada a 30ºC 0,67% (w/v) do meio mínimo: Base Nitrogenada de levedura(YNB) + aminoácido apropriado de 50mg/mL e 2% glicose ou 2% galactose como fonte de carbono cultivada a 37ºC Meio LB (Luria-Bertani) 100ug/mL de ampicilina ou 25 ug/mL de zeocina seleção dos clones transformados 1% de glicerol (BMGY) ou 0,5 de metanol (BMMY) E. coli indução PUC19 pCYTEXP1 pPICZαB

40 Cepas, plasmídeos e meios Para manter as culturas de leveduras foi usado o meio YEPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona e 2% de dextrose) Para selecionar os transformantes de P. pastoris foram utilizadas placas contendo zeocina (100mg/mL) e meio YEPS (YEP + 2% de sorbitol)

41 Design do gene, síntese do cassete e montagem do códon do gene otimizado Gene foi dividido em 4 fragmentos de ca. 400pb cada clonados separadamente 4 subcontruções resultantes: Após remoção de mutações indesejáveis Cassete I Cassete II Cassete III Cassete IV 4 oligonucleotídeos 6 oligonucleotídeos Cada cassete foi sintetizado em uma etapa Vetor de clonagem pUC19 pUC-IpUC-II pUC-IIIpUC-IV digerido com Smal corte abrupto clonados em pUC19

42 Design do gene sintético Cassete ICassetes II a IV 4 oligonucleotídeos6 oligonucleotídeo gene Lip1

43 Design do gene sintético O gene completo da lipase sintética foi montade em pUC19 Posteriormente, o fragmento XmaI-EcoRI de pUC-(II-III) foi inserido no pUC-I resultando em pUC-(I-III) O fragmento de EcoRI-EcoRI da pUC-IV foi clonado em pUC-(I-III ) Fragmento de XmaI/blunt-SalI da pUC-II estava ligado na pUC-III PstI/IbluntSalI anteriormente linearizada com pUCII, pUC III cortado com EcoRI Vetor de clonagem corretamente montado pUC-(I-IV) Identificado e caracterizado pela análise de enzimas de restrição Sequência inteira foi reconfirmada pelo sequenciamento automatizado XmaI e EcoRI

44 Construção dos vetores de expressão Lip1 Gene sintético Lip1 (slip) foi subclonado passo intermediário para a fusão: Fragmento BamHI de pUC(I-IV) estava ligado em um vetor linear de BamHI pCYTEXPI, originando pCY-slip1 vetor pCYTEXP1 sequência líder do fator α de S. cerevisiae gene BamHI vetor pCYTEXPI pCY-slip1

45 Construção de vetores de expressão de Lip1 Sequência que codifica a lipase Sequência do fator alfa presente no vetor de expressão de P. pastoris (pPICZαB) primer complementar a sequência pPICZαB PCR O produto obtido da PCR foi clonado em SphI/blunt linearizado com pCYTEXPI, resultando em pCY-prepo-fator-α O fragmento BglI de pCY-slip1, contendo toda a forma madura do gene sintético da lipase, foi inserido no plasmídeo digerido (pCyprepo-fator-α), restaurando assim o gene de resistência a ampicilina O plasmídeo obtido (pCYpp-slip1), contendo o gene sintético da lipase madura, fundiu a sequência líder prepo-fator-α, foi digerido (BamHI/bluntHindIII), e o fragmento resultante foi ligado dentro de pPICZαB linearizado com XbaI/blunt-HindIII, gerando pPIC-pp-slip1. pCY-pp-fator-α Sequência que codifica a lipase contém os fragmentos: SphI, BglI + gene sintétido da lipase Sequência líder prepo-fator--α fragmento resultante ligado em pPICZαB contém os fragmentos: SphI, BglI + gene sintétido da lipase pPIC-pp-slip1 linearizado com XbaI/blunt-HindIII

46 Construção de vetores de expressão de Lip1 Como vetor de expressão em células de S. cerevisiae, foi usado um vetor contendo um promotor forte de indução da galactose (GALI-GALIO). pPIC-nl-slip1 foi digerido com BamHI e ligado a pYES2 com a mesma enzima, e desfosforilado, originando PY-nl-slip1. PY-nl-slip1 foi utilizado para clonagem no vetor pYES2 do gene sintético da lipase, procedido pelas sequências prepo-sinal fator alfa e pre-sinal. Os fragmentos HindIII-BsteII contendo os genes recombinantes foram isolados a partir de pPIC-pp-slip1 e pPIC-p-slip1, e inseridos em pYES2, digerido com a mesma enzima. Os plasmídeos obtidos foram chamados de pY-pp-slip1 e pY-p-slip1, respectivamente.

47 Expressão de Lip1 em: P. pastoris S. cerevisiae

48 Expressão de Lip1 em P. pastoris Cepa: GS115 Transformadas com o vetor pPIC-pp-slip1 por eletroporação Transformantes plaqueamento em meio seletivo sólido (YEPD) contendo zeocina Clones produtores de lipase halo claro Todos os transformantes obtidos com pPIC-pp-slip1 exibiram atividade lipásica após incubação 'overnight' verificação da atividade da lipase transferência das colônias para placas de tributirina-metanol incubadas a 30ºC 48h 0,1mL de metanol adicionado a cada 24h em cada tampa detecção de microorg. lipolíticos células de Pichia transformadas com pPICαB nunca formaram halos

49 Expressão de Lip1 em S. cerevisiae Células de S. cerevisiae Invsc2 Transformadas com pY-nl-slip1, pY-pp-slip1 e pYpreLIP por eletroporação Transformantes foram plaqueados em meio mínimo sólido contendo tributirina e galactose selecionados com base na capacidade de crescimento na ausência de leucina selecionados pela produção e secreção de lipase halos transparentes na placa contendo tributirina

50 Fermentações Realizada em um biorreator 1-L a 30ºC em meio padrão rico BMMY Fermentação com alta densidade de células Biorreatores: inoculados com 50mL da cultura de balão crescida 'overnight', com uma DO 600 =2-3 no meio BMGY mantida em pH constante Monitoramento: atividade lipolítica dos sobrenadantes, peso úmido das células adição de HCl 2M, NaOH 2M pH 6,0 pH 7,0 adição de metanol após a cultura alcançar 75mg/mL de peso úmido adição de 5mL de metanol diariamente

51 Caracterização físico-química e catalítica Realizada diretamente com o sobrenadante da cultura, sem qualquer tipo de purificação Atividade da lipase medido rotineiramente com tributirina como substrato em um ensaio de pH-stat a 30ºC e pH 7,2 utilizou-se como substrato: 20mM de triglicérides 5% (w/v) de manteiga de cacau emulsificado em água destilada contendo goma arábica (20mg/mL) e usada como uma solução de substrato no ensaio de pH-stat a 30ºC e pH 7,2 sobrenadante da cultura de pequena escala: ensaio com espectrotofômetro usando p-nitrofenil palmitato como substrato a 30ºC Atividade da lipase Especificidade do substrato Atividade da lipase

52 Caracterização físico-química e catalítica Emulsão triesterarina obtida pela adição de 5% de acetona (v/v) Retirou-se 2mL da mistura de reação, parando a reação lipolítica pela adição de 0,1mL de ácido ortofosfórico Foi extraído 3 vezes ácidos graxos livres com dietileter-n-hexano (1:1) e 50uL do extrato de ácidos graxos, que secou-se sob nitrogênio. nessas condições as lipases retêm 47% de sua plena atividade em tributirina Especificidade do substrato Substrato: esteres metílicos de ácido graxo Preparou-se: 110mM da mistura dos esteres metílicos de ácido graxo e 5mM Tris-tampão com pH 7,5 10mM de cada éster Lipólise pH-stat a 30ºC e pH 7,2, até a titulação de 6,6mM de ácidos graxos livres

53 Características físico-química e catalítica Os 3 ácidos graxos livres foram derivados para os silil éteres pela adição de 50uL de MSHFBA(N-metil-N-trimetil-hepta-fluorbutirâmido) e incubação a temperatura ambiente por 15 min Determinou-se pela cromatografia gasosa após uma nova adição de 50uL de etanol e 200uL de n-hexano (cromatografia gasosa: Fison 800), temperatura de 40ºC por 2 min, 4ºC por 1 min, 250ºC por 15 min, injetor a 350ºC, detector de ionização de chama a 360ºC a 75kPa

54 Caracterização físico-química e catalítica Efeito do pH Efeito da temperatura Determinado a 30ºC e pH 7,2 Determinado em diversas temperaturas Atividade da enzima Após a incubação das alíquotas da solução de lipase por : 20h a 30ºC em 0,1M de tampão de fosfato em diferentes pHs 30 min em 25 mM tampão Tris em pH 7,5 a diferentes temp

55 Métodos analíticos Análise da sequência N-terminal sequenciador de fase gasosa 470A (Applied Biosystems) Sobrenadante que continha a lipase SDS-PAGE Após 'blotting' em uma membrana PVDF, a banda da lipase foi cortada e utilizada para determinação da sequência N-terminal Immunoblot Utilizando anticorpos policlonais específicos para a lipase homóloga de Geotrichum candidum

56 Métodos analíticos relizada com endo-B-N-acetilglicosamindase H por 12h a 37ºC em um tampão de acetato de potássio de 50mM com pH 5,5 contendo 0,5mM de PMSF a proteína foi primeiramente incubada a 95ºC por 3 min com 0,1% (m/v) de SDS, e a reação foi realizada por 24h Deglicosilação das amostras desnaturadas enzima inibidor de proteases

57 Obrigado!


Carregar ppt "Design, síntese total e superexpressão funcional do gene lip1 de Candida rugosa codificando para uma grande lipase industrial Amanda F. Sarmento Nathani."

Apresentações semelhantes


Anúncios Google