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Gustavo Garcia Luiz Gustavo Gardinassi Thais Herrero pDCs play off scratch.

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Apresentação em tema: "Gustavo Garcia Luiz Gustavo Gardinassi Thais Herrero pDCs play off scratch."— Transcrição da apresentação:

1 Gustavo Garcia Luiz Gustavo Gardinassi Thais Herrero pDCs play off scratch

2 Modelo de desenvolvimento das células dendríticas

3 Função das células dendríticas

4 Subpopulações de Células Dendríticas CD45 +

5 LC- células de Langerhans IDEC- células dendríticas epidermal inflamadas. PDC- células dendríticas plasmocitóides CD123- cadeia alfa do receptor da IL-3

6 RT-PCR J. Exp. Med- September 17, 2001

7 Nature Reviews Immunology 8, (April 2008) Importância da produção dos IFNs do tipo 1

8 Expressam TLR7 e TLR9 Produz grande quantidade de interferons tipo 1 pDC são população de células circulantes Ausentes na pele normal, porém migram para pele inflamada

9 LL37/CRAMP- peptídeo antimicrobiano catelicidina

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11 Controle da infecção/lesão Autoimunidade

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13 Objetivo: Avaliar o papel das células dendríticas plasmocitóides (pDCs) durante a lesão da pele e no processo de cicatrização

14 Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs? Derme Quantificação das células dérmicas Digestão com 1mg/ml de colagenase por 2h

15 Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs? Assim, lesões na pele induz uma infiltração rápida e robusta de pDCs paralela à infiltração por neutrófilos no local da lesão.

16 Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I? Pele total (0, 6, 24, 48 e 72h) Análise da expressão gênica por Real-time PCR As pDCs são a principal fonte de IFN-α/β na lesão, enquanto as citocinas inflamatórias IL-6 e TNF são produzidas por outros tipos celulares que não as pDCs.

17 Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I? 48hs 24hs 2 Acs (PDCA1 e mAb 927) ou IgG como controle antes da lesão 48hs 24hs Acs (anti- Ly6C) ou IgG como controle antes da lesão 24h Demonstrando que a pele danificada induz uma rápida infiltração e ativação de pDCs.

18 Os TLRs estariam envolvidos na ativação pDCs e produção de INF-α/β? MyD88 -/- Pele total (24h) Análise da expressão gênica por Real-time PCR Lesão IRS 954 (0, 1, 10 ou 100μg) Lesão Pele total (24h) Análise da expressão gênica por real-time PCR

19 As catelicidinas são induzidas neste modelo de injúria de pele? Pele total (0, 6, 24, 48 e 72h) Análise da expressão de catelecidina (CRAMP) por Real- time PCR pDCs do baço Overnight DNA CRAMP CRAMP+DNA scCRAMP+DNA scCRAMP ELISA Sugere-se um potencial papel das catelicidinas na quebra da tolerância inata para ácidos nucléicos próprios.

20 As catelicidinas estariam também envolvidas com a quebra da tolerância inata contra ácidos nucléicos in vivo? CRAMP scCRAMP Salina Pele total (0, 24 e 48h) FACs Real-time PCR Sim, CRAMP é suficiente para quebrar a tolerância inata e induzir a ativação de pDCs e produção de IFNs na pele in vivo.

21 Pele total (24h) Análise da expressão gênica por Real-time PCR Com ou sem lesão CRAMP -/- As catelicidinas são necessárias para a ativação das pDCs na pele danificada? Assim, as cetelicidinas são suficientes, mas não necessárias para a quebra da tolerância inata a ácidos nucléicos e induz a produção de IFN-α/β pelas pDCs na pele danificada.

22 As pDCs induzem uma resposta inflamatória na pele danificada? 2 Acs (PDCA1 e mAb 927) ou IgG como controle antes da lesão Pele total (24h) Citocinas inflamatórias por Real-time PCR Com ou sem lesão Estes resultados demonstram que as pDCs infiltrantes, desenvolvem um papel importante na indução da resposta imune inflamatória na pele danificada, e em particular a indução de IL-6 e citocinas Th17

23 As pDCs teriam um papel na reepitelização da pele danificada? Pele com lesão Análise da expressão de Keratina 6 (K6) Imunofluorescência Estes resultados indicam que a infiltração das pDCs na pele danificada desenvolvem um papel importante na pele danificada promovendo uma rápida reepitelização da lesão.

24 Qual seria o papel dos IFN-α/β neste processo? IFNAR -/- Pele com lesão Quantificação da Keratina 6 (K6) e análise da expressão das citocinas inflamatórias por Real-time PCR Estes resultados sugerem que a capacidade das pDCs dispararem uma rápida resposta inflamatória e promoverem o reparo do tecido esta relacionado a ativação dos TLR mediada por ácidos nucléicos e produção de IFN-α/β.

25 E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade? Biópsias antes e 24h depois da lesão 7 voluntários Fita adesiva Imunoistoquímica para BDCA2 (marcador específico de pDCs humana) e Real-time PCR Sim, similar aos resultados obtido no modelo murino, as pDCs foram ativadas e produziram IFN-α na pele danificada.

26 E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade? Biópsias antes e 24h depois da lesão 7 voluntários Lauril sulfato de sódio (SLS) Imunoistoquímica para BDCA2 (marcador específico de pDCs humana) Assim como no modelo de lesão mecânica, o modelo de lesão química induziu uma rápida infiltração de pDCs e uma significante indução da expressão de mRNA de IFN-α na pele danificada.

27 Conclusão Controle da infecção/reparo tecidual

28 Objetivo: Investigar o papel das pDCs na inflamção da pele de indivíduos suscetíveis a doença autoimune

29 Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos? Linhagem 129 Tape stripping 24h Citometria de fluxo

30 Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos? Após a inflamção, pDCs e neutrófilos infiltram-se na pele, onde pDCs produzem IFN-  e neutrófilos produzem NETs. Linhagem 129 Tape stripping 24h Imunomarcação

31 INFAR - / - ou WT Naive/Tape stripping 24h Real Time PCR Os IFN tipo I atuam na indução de genes pró- inflamatórios na pele lesionada?

32 A indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada envolve a sinalização via TLR? MyD88 - / - ou WT Naive/Tape stripping 24h Real Time PCR O requerimento de MyD88 na indução de genes pró-inflamatórios demonstra um importante papel da sinalização via TLR.

33 Naive/Tape stripping 24h Real Time PCR Os TLR7 e TLR9 estão envolvidos na indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada? IRS 954 Sim, a sinalização via TLR 7 e TLR 9 é necessária para mudanças na expressão de genes pró-inflamatórios na pele danificada.

34 pDC e Neutrófilos são necessários para a indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada? Naive/Tape stripping 24h Real Time PCR Anti-120G8 Anti-GR1-Ly-6G WT pDC e Neutrófilos são requeridos para a indução de genes pró- inflamatórios, porém promovem respostas inflamatórias diferentes.

35 Quais as características da resposta inflamatória de (NZBXNZW)F 1 na pele lesionada? Tape stripping 1, 4, 20d Real Time PCR Quant. Lesão aberta Histologia (NZBxNZW)F 1 C57/BL6 129

36 Quais as características da resposta inflamatória de (NZBXNZW)F 1 na pele lesionada? Após a inflamação, (NZBXNZW)F 1 desenvolvem lesões crônicas na pele, semelhantes a lesões observadas em CLE de humanos.

37 pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas para iniciar e manter lesões cutâneas? Tape stripping 15-23d Quant. Lesão aberta (NZBxNZW)F 1 Anti-120G8 ou IRS 954

38 pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas para iniciar e manter lesões cutâneas? As pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas, pois a depleção de pDC e a inibição dos receptores tanto antes, quanto durante a inflamação, resultam em uma melhora da cicatrização. Tape stripping 15-23d Quant. Lesão aberta Histologia (NZBxNZW)F 1 4d IRS 954

39 Conclusão Autoimunidade Controle da infecção/reparo tecidual ? Doença Exacerbação da lesão


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