Real Time PCR.

Apresentação em tema: "Real Time PCR."— Transcrição da apresentação:

1 Real Time PCR

2 O Que é? Reação de PCR cuja detecção dos amplicons é simultânea a amplificação, não necessitando de etapas posteriores como gel de eletroforese ou detecção radioativa , “like” ELISA ou Blots.

3 Tipos SYBR Green TaqMan/FRET Molecular Becons LUX Scorpions outros

4 Vantagens Rápida ciclagem Alto Throughput Baixo risco de contaminação
Muito sensível Larga faixa dinâmica Reprodutibilidade Quantificável Não é mais caro que PCR convencional

5 PCR

6 Química da fluorescência
TaqMan SYBR Green

7 TaqMan Atividade 5’-Nuclease

8 Atividade da Taq Taq 5’ nuclease Síntese Nucleotídeo 5’ 3’
Direção da síntese

9 A Atividade 5’-Nuclease não altera a PCR

10 Fluorescent Resonant Energy Transfer
TaqMan utiliza FRET Fluorescent Resonant Energy Transfer

11 TaqMan usa uma Probe Fluorescente
Reporter Quencher

12 Taq Extende do Primer Upstream

13 A atividade 5’-Nuclease digere a Probe

14 Aumento do sinal do Reporter durante a Amplificação
Número de ciclos

15 SYBR Green I Corante Minor Groove Binding. Sem probe; Custo mais baixo
que TaqMan Menos que 0.5g de DNA na amostra. Não aceita multiplex.

16 Especificidade TaqMan Alta especificidade, inerente a química.
SYBR Green Baixa especificidade. Espec. observada apenas no “Melt Curve”

17 PCR quantitativo Expressão gênica transgênicos Quant. Câncer
Qt patógenos

18 Fases da PCR Plateau Linear Gel EtBr Log [DNA] Geométrica # ciclos

19

20 Fase geométrica y = 2X

21 Problemas nas fases linear e plateau
Fase linear Efeito Plateau

22 PCR Qt tradicionais . . . . . Uso de competidores
Compartilha mesmos primers. Competidor = tamanhos diferentes. Compartilhar mesmas condições. Métodos radio / ELISA. . Gráfico conc. . . Limite de número de ciclos. . .

23 São evitadas as fases linear e plateau.
O Que faz o Real Time? A tecnologia Real Time tem acesso a fase Geométrica maior qualidade. São evitadas as fases linear e plateau.

24 Calibração externa DNA/RNA são amplificados como uma curva
separada para compensar a eficiência e fornecer unidades de quantificação target A Detection threshold target B Log [DNA] # ciclos

25 Características do gráfico Real Time
Log [DNA] Cycle # Plateau Y=X(1+e)n Geometric Y=X2n Real-Time PCR Características do gráfico Real Time 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 5 10 15 20 25 30 35 40 Número de ciclos PCR Baseline Threshold C T Controle sem Template Amostra Fluorescência Normalizadada ”reporter” (Rn) Fase geométrica Alta CV baixa CV Rn CT é inversamente proporcinal a conc. de DNA

26 Plot da Amplificação

27 Curva Padrão y= -3.6x + 39 R2= 7 pg DNA 700 ng DNA

28 OBRIGADO