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Setembro/2004 Real Time PCR.

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Apresentação em tema: "Setembro/2004 Real Time PCR."— Transcrição da apresentação:

1 Setembro/2004 Real Time PCR

2 Setembro/2004 O Que é? Reação de PCR cuja detecção dos amplicons é simultânea a amplificação, não necessitando de etapas posteriores como gel de eletroforese ou detecção radioativa, “like” ELISA ou Blots.

3 Setembro/2004 Tipos SYBR Green TaqMan/FRET Molecular Becons LUX Scorpions outros

4 Setembro/2004 Vantagens Rápida ciclagem Alto Throughput Baixo risco de contaminação Muito sensível Larga faixa dinâmica Reprodutibilidade Quantificável Não é mais caro que PCR convencional

5 Setembro/2004 PCR

6 Setembro/2004 Química da fluorescência SYBR Green TaqMan

7 Setembro/2004 TaqMan Atividade 5’-Nuclease

8 Setembro/2004 Atividade da Taq 5’ nuclease Síntese Nucleotídeo Taq 5’3’ Direção da síntese

9 Setembro/2004 A Atividade 5’-Nuclease não altera a PCR

10 Setembro/2004 TaqMan utiliza FRET Fluorescent Resonant Energy Transfer

11 Setembro/2004 TaqMan usa uma Probe Fluorescente Reporter Quencher

12 Setembro/2004 Taq Extende do Primer Upstream

13 Setembro/2004 A atividade 5’-Nuclease digere a Probe

14 Setembro/2004 Aumento do sinal do Reporter durante a Amplificação Número de ciclos

15 Setembro/2004 SYBR Green I Corante Minor Groove Binding. Sem probe; Custo mais baixo que TaqMan Não aceita multiplex. Menos que 0.5  g de DNA na amostra.

16 Setembro/2004 Especificidade TaqMan Alta especificidade, inerente a química. a química. SYBR Green Baixa especificidade. Espec. observada apenas no “Melt Curve”

17 Setembro/2004 PCR quantitativo Expressão gênica transgênicos Quant. Câncer Qt patógenos

18 Setembro/2004 Fases da PCR Log [DNA] # ciclos Geométrica Plateau Linear Gel EtBr

19 Setembro/2004

20 Setembro/2004 Fase geométrica y = 2 X

21 Setembro/2004 Problemas nas fases linear e plateau Fase linear Efeito Plateau

22 Setembro/2004 PCR Qt tradicionais Uso de competidores Compartilha mesmos primers. Compartilhar mesmas condições. Competidor = tamanhos diferentes. Métodos radio / ELISA. Gráfico conc. Limite de número de ciclos......

23 Setembro/2004 O Que faz o Real Time? A tecnologia Real Time tem acesso a fase Geométrica maior qualidade. São evitadas as fases linear e plateau.

24 Setembro/2004 Calibração externa DNA/RNA são amplificados como uma curva separada para compensar a eficiência e fornecer unidades de quantificação # ciclos Detection threshold target A target B Log [DNA]

25 Setembro/2004

26 Setembro/2004 Plot da Amplificação

27 Setembro/2004 Curva Padrão 7 pg DNA 700 ng DNA y= -3.6x + 39 R 2 = 0.999

28 Setembro/2004 OBRIGADO


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