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Introdução Juniperus brevifolia (Seub.) Antoine (Cupressaceae) é uma espécie lenhosa endémica dos Açores com grande importância ao nível da estrutura e.

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1 Introdução Juniperus brevifolia (Seub.) Antoine (Cupressaceae) é uma espécie lenhosa endémica dos Açores com grande importância ao nível da estrutura e funcionamento de várias comunidades vegetais endémicas dos Açores (Dias, 1996; Dias et al. 2004; Elias, 2001; Elias & Dias, 2004). Os objectivos deste trabalho são os seguintes: - Determinar a variabilidade genética intra e inter-populacional em populações naturais e de viveiro; - Estimar o grau de diferenciação genética das populações; - Avaliar as consequências ao nível taxonómico; - Avaliar as consequências ao nível da conservação. Variabilidade genética de populações naturais e em viveiro de Juniperus brevifolia (Seub.) Antoine (Cupressaceae) Luís Silva 1, Rui Elias 2, Eduardo Dias 2, Mónica Moura 1, Samuel Menard 1 e Sandra Couto 1 1 Departamento de Biologia, CIRN, Universidade dos Açores, Apartado 1422, PT Ponta Delgada, Portugal; Telefone: ; fax: ; 2 Departamento de Ciências Agrárias, CITA, Universidade dos Açores, Largo da Igreja, Terra-chã, Portugal. Telefone: ; Fax: ; Material e Métodos Amostragem - As amostras incluem, sempre que possível, 10 indivíduos de cada população (5 plantas femininas e 5 masculinas). Foram amostradas 6 populações na Ilha Terceira e 2 na Ilha do Pico. Sempre que possível, evitou-se a amostragem de plantas vizinhas. Extracção de DNA - O DNA foi extraído a partir dos raminhos terminais, mantidos no frigorífico até ao início do processo de extracção. O material excedentário foi conservado a –80ºC. Todo o material foi processado recorrendo ao kit de extracção DNeasy Plant Mini kit (Qiagen). Verificação da qualidade e quantidade do DNA extraído - As amostras de DNA, mantidas em tampão TE e no congelador a –20ºC, foram analisadas num gel de agarose a 1,2 % de modo a aferir da presença e da quantidade de DNA extraído. Amplificação - Por reacção foram utilizados 10 µmol/L (1µL) do respectivo primer, cerca de 35 ng de DNA purificado (1µL) e um tubo de 0,2 ml com puReTaq Ready- To-Go PCR bead (Amersham Biosciences), para um volume final de 25 µl. A reacção de amplificação foi realizada num amplificador T-Gradient (Whatman Biometra) com o seguinte programa: i) desnaturação 3 min a 94ºC; ii) 45 ciclos de amplificação (94ºC, 1 min; 36ºC, 1 min; 72ºC, 2 min); iii) extensão final de 4 min a 72ºC. Análise dos fragmentos amplificados - Os fragmentos de DNA resultantes da amplificação foram separados num gel de agarose a 1,4% (tampão TBE), corados com brometo de etídio e visualizados com o sistema Gel Doc Foi utilizado como referência um marcador molecular de 50–2000 ou de 50–10000 pares de bases (Sigma-Aldrich). Análise estatística - As bandas polimórficas foram registadas como presentes (1) ou ausentes (0). Para evitar enviesamentos as bandas com uma frequência inferior a 3/N (N é a dimensão da amostra) foram excluídas da análise (Lynch & Milligan, 1994). A diversidade fenotípica (com base nas bandas) foi estimada por população, por ilha e globalmente, utilizando o índice de Shannon (Morgan-Richards & Wolff, 1999). A variação genética dentro das populações, dentro das ilhas, entre populações e entre ilhas foi estimada utilizando uma Análise de Variância Molecular (AMOVA) com a aplicação Arlequin ver (Schneider et al., 2000). A diferenciação genética das populações foi estimada, com base nas distâncias Euclideanas entre indivíduos, as quais foram utilizadas no cálculo dos valores de F ST (Schneider et al., 2000). Foi construída uma árvore (Neighbor-Joining tree) com base na matriz de distâncias (Nei & Li, 1979), recorrendo à aplicação RAPDistance 1.06 (Armstrong et al., 1994). Bibliografia Adams, R. P., A.. Schwarzbach and R. N. Pandey (2003). The concordance of terpenoid, ISSR and RAPD markers, and ITS sequence data sets among genotypes: na example from Juniperus. Biochemical Systematics and Ecology, 31: Armstrong, J., Gibbs, A., Peakall, R. and G. Weiller (1994). The RAPDistance Package. Australian National University, Canberra, Australia. Dias E Vegetação natural dos Açores. Ecologia e sintaxonomia das florestas naturais. Tese de Doutoramento. Universidade dos Açores. Angra do Heroísmo, Azores. Dias E., Elias R. B. & Nunes V. (2004). Vegetation mapping and nature conservation: a case study in Terceira Island (Azores). Biodiversity and Conservation 13: Elias R. B. (2001). Sucessão primária em domas traquíticos. Tese de Mestrado em Ecologia Insular e Evolução. Universidade dos Açores, Departamento de Ciências Agrárias. Angra do Heroísmo, Azores. Elias R. B. & Dias E. (2004). Primary succession on lava domes on Terceira (Azores). Journal of Vegetation Science 15: Lynch, M., and B. Milligan (1994). Analysis of population-genetic structure using RAPD markers. Molecular Ecology 3: Morgan-Richards, M. and K. Wolff (1999). Genetic structure and differentiation of Plantago major reveals a pair of sympatric sister species. Molecular Ecology, 8: Nei, M. and W.-H. Li, (1979). Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 76: Schneider, S., D. Roessli, and L. Excoffier (2000). Arlequin ver : A software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland. Conclusões A variabilidade genética intrapopulacional é relativamente elevada. A distância genética, considerável, encontrada entre amostras das ilhas Terceira e do Pico, indica que se deverá proceder com cautela no que respeita à utilização das plantas originárias do Pico em outras ilhas dos Açores. Deve ainda considerar-se o facto da população de viveiro apresentar a diversidade genética mais reduzida. Dada a distância genética encontrada entre populações de diferentes ilhas, nesta fase do estudo aconselha-se que o material vegetal de uma ilha não seja utilizado para plantio noutra ilha. Uma tal prática acarretaria, muito provavelmente, uma progressiva homogeneização ao nível genético das populações de J. brevifolia das diferentes ilhas. No que respeita à variabilidade genética de J. brevifolia na ilha Terceira, esta é uma realidade, pelo que, os dados referentes aquela Ilha serão alvo de uma análise mais detalhada, de modo a confirmar a estrutura genética agora detectada. Resultados Dos 30 primers inicialmente testados, foram aplicados 5 primers RAPD e 5 primers ISSR. Utilizaram-se 8 amostras (72 indivíduos) o que resultou na análise de um total de 140 bandas polimórficas. Tabela 2. A diversidade genética, estimada através do índice de Shannon, foi relativamente elevada no interior das populações (67%), com alguma variabilidade entre ilhas e entre populações. Figura 2. Estrutura genética de 8 populações de Juniperus brevifolia das ilhas Terceira e Pico. Dendrograma baseado na distância genética de Nei. Existe uma estrutura genética algo complexa ao nível da Ilha Terceira. Observa-se um certo agrupamento das populações de Mistérios Negros e Cão Morto, por um lado, e das populações de Sanguinhal, Mistérios e Serra de Santa Bárbara, por outro, ficando a população das Quatro Ribeiras algo isolada, e aparentemente mais próxima das populações do Pico. Tabela 3. Análise da variância molecular - foram definidos dois grupos (6 populações da ilha Terceira e 2 populações da Ilha do Pico). Confirma-se que a percentagem de variabilidade genética dentro das populações (61%) é o factor responsável pela maior parte da variância encontrada. Tabela 4. Distância genética entre as amostras analisadas. Todas as distâncias são significativas (* p<0,05). Foram encontradas distâncias genéticas consideráveis entre as populações amostradas, especialmente entre populações de ilhas diferentes. Figura 1 – Géis obtidos utilizando primers do tipo RAPD e ISSR. TMN TCM TS TC TS TM TQR PM PV Tabela 1. Populações amostradas nas ilhas Terceira (6) e Pico (2). Agradecimentos: Ao Engº. Jorge Belerique pelo apoio prestado. Financiado pela Direcção Regional dos Recursos Florestais - Açores Helder Fraga


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