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Fabiane Maria Lima Sousa Mestranda PPGZ-UFC Orient.: Prof.: Arlindo Moura.

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Apresentação em tema: "Fabiane Maria Lima Sousa Mestranda PPGZ-UFC Orient.: Prof.: Arlindo Moura."— Transcrição da apresentação:

1 Fabiane Maria Lima Sousa Mestranda PPGZ-UFC Orient.: Prof.: Arlindo Moura

2 A digestão é necessária para que todas as partes da proteína fiquem uniformemente expostas à dissociação e ionização, e para aumentar a eficiência desses processos. As bandas/spots protéicos correspondentes à proteína de interesse serão: 1. Excisadas 2. Descoradas 3. Submetidas à digestão enzimática

3 Imagem gerada pelo PDQuest: Master gel

4 Proteases normalmente utilizadas: o Quimotripsina o Pepsina o Carboxipeptidases o Aminopeptidases o Tripsina ou uma combinação delas Capacidade Previsibilidade Disponibilidade

5 Cuidados no procedimento Manter o gel umedecido com água destilada para evitar o ressecamento. Deve-se usar reagentes de boa qualidade e procedência conhecida. Durante os procedimentos de corte e digestão, é importante o uso de luvas, jaleco de mangas compridas, e, se possível, touca e máscara, para evitar contaminações, a principal é a queratina humana.

6 Etapas do procedimento Excisão ou corte dos spots o Spot no gel, é cortado no centro e dividido em pedaços menores. o Existem os métodos manuais (tesoura, bisturi ou gilete), e existe um método computadorizado (spot picker).

7 Excisão manual com bisturi

8 Método computadorizado (Spot picker)

9 Lavagem do gel o Solução de acetonitrila/bicarbonato de amônio o Desidratado o gel com acetonitrila o Remover a acetonitrila e secar completamente os géis no Speed Vac.

10 Digestão com tripsina o Solução de tripsina diluída será distribuída de forma a cobrir os pedaços de gel. o Extração dos peptídeos (por meio de lavagens)com ácido fórmico 5% ou TFA 5%/ acetonitrila 50%. o Concentrar as amostras.

11

12 Obrigada


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