Prof. Igor Dias Medeiros, Dr.

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1 Prof. Igor Dias Medeiros, Dr.
EXPRESSÃO DE GENES BIOMARCADORES EM OSTRAS Crassostrea gigas EM RELAÇÃO AO SEXO. Bruna.H. de Oliveira Acadêmica de Naturologia Aplicada Bolsista PIBIC/CNPq Prof. Igor Dias Medeiros, Dr. Orientador

2 Introdução A contaminação dos ecossistemas pode afetar os organismos expostos causando alterações, que normalmente iniciam ao nível molecular e se estendem ao organismo como um todo, podendo refletir na estrutura das populações e comunidades (Pina et al, 2007). As alterações decorrentes da exposição à contaminação pode ser utilizada para monitorar a exposição e efeitos destes compostos sobre os organismos, sendo denominada biomarcador de contaminação (Medeiros et al, 2008).

3 Introdução A análise com biomarcadores permite avaliar além da presença dos contaminantes os efeitos dos mesmos, indicando biodisponibilidade do composto em questão (Hugget et al, 1992). Vários parâmetros podem ser utilizados na análise dos biomarcadores de contaminação, entretanto a expressão gênica é uma das primeiras alterações detectáveis, contribuindo para uma avaliação precoce da situação (Finne et al, 2007).

4 Introdução A exposição prévia de ostras a esgoto doméstico não tratado permitiu a identificação de alguns genes cuja expressão foi induzida na presença deste contaminante (Medeiros et al, 2008). Entre estes estão o gene da proteína ligante de ácidos graxos (FABP), citocromo P450 isoforma 356A1 (CYP356A1) e glutationa S-transferase classe ômega (GSTO) e proteína de resistência à múltiplos xenobióticos (MXR).

5 Introdução: FABP é responsável pela ligação e transporte de ácidos graxos entre os compartimentos celulares, podendo transportar também outros compostos lipofílicos como alguns contaminantes (Velkov et al, 2005). O citocromo P450 corresponde a uma família de proteínas de biotransformação de fase I, responsável por transformar substâncias lipossolúveis em hidrossóluveis, facilitando assim sua excreção (Livingstone, 1998).

6 Introdução: As GSTs são enzimas de biotransformação de fase II que conjugam os xenobióticos com o tripeptídeo glutationa, aumentando sua hidrosolubilidade e facilitando sua excreção (Sheehan , 1998). A classe ômega parece estar associada à defesas antioxidantes (Board et al, 2000). MXR é uma proteína de membrana que transporta para fora da célula contaminantes de diferentes classes, inclusive moléculas transformadas pelas proteínas de faseI e II (Bard, 2000).

7 Objetivo Este trabalho teve por objetivo investigar se existe diferença entre os sexos na expressão dos genes FABP, CYP356A1, GSTO e MXR, normalizados pelo gene da actina (ACT), em ostras Crassostrea gigas.

8 Metodologia: Coleta: foram coletadas 20 ostras Crassostrea gigas (7 – 10cm) além de amostras de água para avaliação da qualidade no Cultivo comercial “Mexilhostras”, localizado na Ponte do Imaruím, Palhoça, SC; Transferência das ostras para o laboratório e das amostras de água para o Laboratório de Engenharia Ambiental da UNISUL; Morte das ostras por rompimento do músculo adutor; Dissecção das brânquias para homogeneização com o reagente Trizol para extração do RNA total; cada duas ostras do mesmo sexo compuseram uma amostra.

9 Metodologia: Identificação do sexo por microscopia das gônodas;
Quantificação e avaliação da integridade do RNA por espectrofotômetro a 260nm e pela razão 260/280; Síntese do cDNA a partir de 2ug de RNA total com a enzima Omniscripti (Qiagen) e quantificação como descrito acima; PCR com primers específicos para os genes FABP, CYP356A1, GSTO, MXR e ACT;

10 Metodologia: Condições da reação de PCR: 1,2 µg de cDNA; 2 mM MgCl2;
10 mM de cada dNTP; Taq Biotools 1U; 10 µM iniciadores sense e antisense; tampão de PCR 1X; Volume da reação 20uL.

11 Metodologia: Eletroforese em gel de agarose 1,2% TAE 1X e corado com brometo de etídio para observação em luz UV; Densitometria das bandas através do software E-Capt; Análise estatística com teste t de Student (p<0,05).

12 Resultados: A água do local de coleta apresentou salinidade 21,8; pH 8,03; oxigênio dissolvido 8,3 (mg/L) e turbidez de 15,56 NTV.

13 Resultados: Tabela 1: peso da s brânquias (mg); concentração de RNA total (ug/uL) e razão entre a absorbância a 260 e 280nm das amostras de ostras macho e fêmea (n=5). Machos Peso Brânquia (mg) RNA (ug/uL) 260/280 Fêmeas A 234 2,55 2,03 F 260 6,52 1,79 B 235 5,59 1,88 G 300 7,06 1,64 C 222 4,82 1,94 H 214 5,01 D 225 5,32 I 211 5,00 1,97 E 250 5,05 1,93 J 291 5,51 1,90

14 Resultados: Tabela 2: concentração de cDNA (ug/uL) e razão entre a absorbância a 260 e 280nm das amostras de ostras macho e fêmea (n=5). Machos cDNA (ug/uL) 260/280 Fêmeas A 1,02 1,73 F 1,36 1,79 B 1,31 G 1,42 1,78 C 1,77 H 1,28 D 1,29 I E J 1,26

15 Resultados ACT FABP MXR GSTO
CYP356A1 MXR GSTO Figura 1: expressão dos genes FABP; CYP356A1; GSTO e MDR, normalizados pela actina em brânquias de ostras Crassostrea gigas machos e fêmeas (n=5).

16 Conclusões Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na expressão dos genes investigados em relação ao sexo das ostras, embora as fêmeas apresentem uma expressão de GSTO um pouco maior; A partir desse resultado pode-se afirmar que análises da expressão destes genes em programas de biomonitoramento da contaminação podem ser realizadas sem prévia identificação do sexo dos organismos.

17 Referências Bibliográficas
BARD, S.M. Multixenobiotic resistance as a cellular defense mechanism in aquatic organisms. Aquatic Toxicology. 48, BOARD, F.G.; COGGAN, M.; CHELVANAYAGAM, G.; EASTEAL, S.; JERMIIN, L.S.; SCHULTE, G.K.; DANLEY, D.E.; HOTH, L.R.; GRIFFOR, M.C.; KAMATH, A.V.; ROSNER, M.H.; CHRUNYK, B.A.; PERREGAUX, D.E.; GABEL, C.A.; GEOGHEGAN, C.A. & PANDIT, J. Identification, characterization and crystal structure of the omega class glutathione transferases. The Journal of Biological Biochemistry, v.275, n.32, FINNE, E.F.; COOPER, G.A.; KOOP, B.F.; HYLLAND, K. & TOLLEFSEN, K.E.Toxicogenomic responses in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)hepatocytes exposed to model chemicals and a synthetic mixture. Aquatic Toxicology. 81, HUGGET, R.; KIMERIE, R.A.; MEHRIE, Jr., P.M. & BERGMAN, H.L.Biomarkers: biochemical, physiological and histological markers of anthropogenic stress. Boca Raton, Lewis Publish. 347p

18 Referências Bibliográficas
LIVINGSTONE, D.R. The fate of organic xenobiotics in aquatic ecosystems:quantitative and qualitative differences in biotransformation by 75 invertebrates and fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A. 120, PINÃ, B.; CASADO, M. & QUIRÓS, L. Analysis of gene expression as a newtool in ecotoxicology and environmental monitoring. Trends in AnalyticalChemistry. Vol. 26, No VELKOV, T.; CHUANG, S.; PRANKERD, R.; SAKELLARIS, H.; PORTER, C.J.H. & SCANLON, M.J. An improved method for the puriWcation of rat liver-type fatty acid binding protein from Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 44, 23–

19 Agradecimentos Laboratório de Engenharia Ambiental – UNISUL;
Cultivo de Moluscos Mexilhostras; CNPq. OBRIGADO!