Bioquímica para Enfermagem Prof. Dr. Didier Salmon MSc. Daniel Lima

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1 Bioquímica para Enfermagem Prof. Dr. Didier Salmon MSc. Daniel Lima
Enzimas (Parte II) Bioquímica para Enfermagem Prof. Dr. Didier Salmon MSc. Daniel Lima

2 Cinética Enzimática V = -ΔS/Δt = ΔP/Δt
Estudo da velocidade da reação e dos fatores que a influenciam Pode ser medido por: Quantidade de produto formado por unidade de tempo Quantidade de substrato consumido por unidade de tempo V = -ΔS/Δt = ΔP/Δt Pode ser medida pela quantidade de produto formado: curva azul Ou pela quantidade de substrato consumido: curva vermelha Velocidade vai ser igual a variação do produto/ variação do tempo ou – variação do substrato/ variação do tempo

3 Cinética Enzimática Dosagem por quantidade de produto formado: atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase. Importante na via das pentoses-fosfato, sua reação gera NADPH, cuja presença pode ser detectada em 340nm. Enzima importante para manter um pool de glutationa reduzida, utilizada na defesa contra radicais livres. Sua ausência provoca anemia hemolítica não imune quando as hemácias são submetidas a algum estresse oxidativo Detectada no teste do pézinho.

4 Cinética Enzimática [produto] Velocidade da reação [S] tempo
Atividade enzimática pode ser medida pela velocidade da reação catalisada Em diferentes tubos de ensaios coloca-se as mesmas quantidades de enzimas, diferindo apenas na quantidade de substrato. Após determinado tempo, mede-se a quantidade de produto formado. Isto é melhor representado em um gráfico de velocidade x substrato, como o da direita. Fica claro que um fator importante para a velocidade da reação é a concentração do substrato. Um complicador para tais medidas é o fato de que a [S] varia durante o curso da reação, já que o substrato vai sendo convertido em produto.

5 V0 e Vmáx V0 sobe linearmente a medida que se aumenta a concentração de substrato, e então começa a se nivelar e se aproximar de um ponto máximo onde a velocidade não aumenta, mesmo em concentrações maiores de substrato. Velocidade da reação é proporcional a S Uma maneira de contornar este problema é sempre medir o produto da reação quando ela ainda está acontecendo em sua velocidade inicial (Vo), ou seja, quando a diminuição da concentração do substrato ainda é insignificante. Isso é possível se adicionarmos todos os componentes da reação ao tubo de ensaio e, somente aí, colocarmos a enzima e medirmos a formação do produto. Quando a concentração de substrato é pequena, existe mais enzima livre do que substrato na reação, e a Vo é proporcional a quantidade de substrato. Quando a concentração de substrato é muito grande, toda enzima está complexada em ES, sendo assim, a velocidade da reação não aumenta mais, a enzima alcançou sua capacidade máxima de catálise. Atinge-se um platô no qual a Vo é conhecida como Vmáx. Substrato satura todas as moléculas de enzima

6 V0 e Vmáx

7 Substrato Único K1 K2 E + ES E + P S K -1 K -2
Hipótese: etapa limitante K1 K2 E ES E + P S K -1 K -2 Após curto tempo - estabilidade dinâmica com relação a [E] e [ES] é alcançado Em reações de um único susbtrato, k1 representa a velocidade de formação do complexo ES e k-1 representa sua dissociação. K2 representa a dissociação em enzima livre e produtos. Quando a concentração de substrato é muito grande, um equilíbrio dinâmico entre [E] e [ES] é alcançado rapidamente. A etapa limitante é k2 Esse é o estado estacionário, que é utilizado como parâmetro para toda cinética de Michaelis e Menten.

8 Substrato Único Estado estacionário - [ES] constante
Ou seja: formação do complexo = sua degradação V0 é determinado pela quebra de ES formando o produto V0 = k2[ES] [ES] difícil de determinar. Alternativa! [Et]=[E] + [ES] As velocidades de formação e quebra de ES são determinadas pelas etapas governadas pelas constantes k1 (formação) e k-1 + k2 (quebra em reagentes e produtos) V de Formação de ES = K1 [E] [S] V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES] Quando a quantide de substrato é muito grande, em uma fração de tempo a quantidade de substrato consumido é insignificante e [ES] é constante, ou seja, a formação do complexo é igual a sua degradação. (Cinética do Estado Estacionário)

9 Substrato Único Se V0=k2[ES] Km
[Et]=[E] + [ES] Uma vez que a degradação de ES é igual a sua formação, temos: k1 ([Et]-[ES]) [S] = k–1[ES] + k2 [ES], ou seja: k1[S][Et] - k1[S][ES] = (k–1+ k2) [ES] Dessa forma: [ES] = [Et][S] [S] + (k-1 + k2)/k1 Se V0=k2[ES] V0 = k2. [Et] [S] [S] + Km Km No estado estacionário a velocidade de formação do complexo ES é igual a velocidade de sua dissociação. Substituindo [E] por [Et]-[ES] temos a primeira equação Fazendo a multiplicação temos a segunda. Colocando em função de ES temos a terceira. Apresentação do Km Se Vo = k2.[ES], Vo será igual a k2 vezes a equação anterior (que dava o valor de [ES])

10 Equação de Michaelis-Menten
Na Vmax, [ES] = [Et], assim: Vmax = k2[Et] Substituindo na equação anterior V0 = k2. [Et] [S] [S] + Km temos, V0 = Vmax [S] Na velocidade máxima toda enzima está complexada ao substrato, logo [Et] = [ES] Sendo assim, a Vmax = k2.[Et] Substituindo na equação anterior, temos que Vo = Vmax[S] / ([S] + Km]) = Equação de Michaelis-Menten Observar que o Km quanto maior o Km, menor a velocidade da enzima

11 Propriedade Importante
Quando V0 = Vmax, temos: 2 Vmax = Vmax [S] , [S] + Km Km + [S] = 2 [S], Km = 2 [S] – [S] Km = [S] Ou seja, o Km é igual a concentração do substrato quando a velocidade inicial é metade da velocidade máxima Km = [S] Quando Vo é igual a metade da velocidade máxima, substituindo na equação de Michaelis-Menten temos a primeira equação do silde. Dividindo os dois lados por Vmax e simplificando temos que o Km = [S], Ou seja, o Km é igual a concentração do susbtrato quando a velocidade inicial é metade da Vmax

12 Km Característico de cada enzima.
Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato. O Km é característico de cada enzima e embora seja uma constante de velocidade, reflete a afinidade da enzima pelo substrato. No gráfico temos duas enzimas que catalisam a mesma reação de fosforilação da glicose, hexoquinase e glicoquinase. A glicoquinase, presente no fígado, tem um Km maior do que a hexoquinase, o que reflete uma afinidade menor da glicoquinase pela glicose. São necessárias concentrações maiores de glicose para que a glicoquinase alcance a Vmax

13 Equação de Lineweaver-Burk
O gráfico de Lineweaver-Burk, também conhecido como duplo recíproco é uma inversão da equação de Michaelis-Menten: V0 = Vmax [S] [S] + Km Na equação de Michaelis-Menten a mensuração da Vmax é extremamente complicada devido as altas concentrações do substrato., desta forma criou-se o diagrama do duplo recíproco, que é uma derivação da equação - Permite chegar na Vmax com concentrações baixas do substrato

14 V e [Enzima] A velocidade da reação é proporcional à concentração da enzima Facilita a determinação da concentração de uma enzima Dosagens (transaminases, LDH, amilase, fosfatase alcalina) v0 [E] Uma vez que a Vmax é atingida, a única forma de se aumentar a velocidade da reação é aumentando a quantidade de enzima. A relação entre velocidade e concentração de enzima é proporcional e isso facilita a determinação da concentração de uma enzima, uma dada V0 corresponde a uma concentração enzimática É importante também para dosagens laboratoriais

15 Mais de um substrato... Ex: ATP + d-glicose → ADP + d-glicose-6-fosfato Muitas enzimas do nosso organismo utilizam mais de um substrato para catalisar uma reação (Por exemplo: reações enzimáticas que acoplem o ATP) O exemplo clássico é a hexoquinase

16 Mais de um substrato... Reações em que há 2 substratos envolvem a transferência de átomos ou grupos funcionais de um substrato para o outro: Sequencial (formação do complexo ternário) Dois tipos de reações que envolvem mais de um substrato - As que envolvem a formação de um complexo ternário (Ordenadas ou não) - As que NÃO envolvem a formação do complexo ternário (pingue-pongue ou duplo deslocamento) Complexo Ternário: - Não ordenada: S1 ou S2 podem ligar em momentos diferentes - Ordenada: a ordem de ligação interfere na reação (ligação de S1 favorece a ligação de S2) Sem complexo ternário - Ex. transaminases: S1 doa grupamento para a Enzima e sai do sitio de ligação. Enzima agora modifica é capaz de doar o grupamento para S2 Pingue-pongue ou duplo deslocamento

17 Inibidores A atividade das enzimas pode ser diminuída ou parada por várias substâncias chamadas de inibidores. Existem inibidores naturais, fazendo parte dos constituintes da célula, e outros estranhos ao organismo que podem provocar alterações do metabolismo celular. Aqueles encontrados nas células são fundamentais para a fisiologia pois permitem às células um controle preciso da velocidade de algumas reações chave, permitindo uma resposta integrada à mudança das condições fisiológicas. Inhibição específica de certas enzimas permita as aplicações farmacológicas Ex: sulfonamidas: usadas para combater as infecções bacterianas Falar de vias antagônicas como a glicólise e a gliconeogênese. A presença de inibidores permite a regulação fina entre as duas vias metabólicas

18 Sulfonamidas Inibidores competitivos da diidropteroato sintetase (dhps), enzima importante envolvida no metabolismo dos folatos (síntese de DNA e RNA) de muitos organismos menos o homem. Os folatos nos serem humanos são fornecidos pela dieta. Toxicidade seletiva para bactérias. Utilizados para tratar: Pneumonia a pneumocystis (Pneumocystis jirovici, P. carinii) IO em pacientes HIV + Infecção do trato urinário Shigelose (Desinteria) Algumas infecções por protozoários (Plasmodium falciparum) As sulfonamidas são inibidores da síntese de folato. Seletivo para bactérias. Não afetam seres humanos porque nós não fazemos folato, retiramos todo ele da dieta.

19 Inibidores Largo campo de aplicação para o combate de insetos
Ex: enzimas digestivas de insetos como as α-amilases catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas α-1,4 do amido, glicogênio e outros carboidratos. Essas enzimas são muito importantes para os insetos, especialmente para aqueles que se desenvolvem em grãos ricos em amido. (No feijão foram identificados 4 desses inibidores) Desenvolvimento de plantas mais resistentes ao ataque das pragas contribuindo para a redução do uso de inseticidas químicos.

20 Inibidores Importância: Agentes farmacêuticos
Ferramentas no estudo de mecanismo de funcionamento das enzimas Ferramenta nos estudos das vias metabólicas Inibidores Reversíveis Irreversíveis Inib. Competitiva (freqüente) Inib. Acompetitiva (quando o inibidor liga-se ao complexo ES , mas não a enzima livre) Inib. Mista Inib. Não-competitiva (caso particular de inib. Mista) Importância dos inibidores: - Agentes farmacêuticos: inibindo uma via metabólica importante de algum patógeno por exemplo, ou diminuindo a ativação de alguma via inflamatória - Estudo do funcionamento de enzimas - Estudo de vias metabólicas. É possível determinar etapas chaves, sequência de reações, etc.

21 Inibidor Irreversível
1-Reagentes específicos para grupo (R) 2- Análogos de substrato 3- Inibidor suicida 1 São inibidores que se ligam covalentemente ao sítio catalítico da enzima ou a algum sítio alostérico importante. São inibidores suicidas pois a ligação não é desfeita, sendo necessária a síntese de mais enzimas. (lembrar do exemplo do malation no ED1) Exemplos no slide: a esquerda, iodocetamida, inibe irreversivelmente cisteína peptidases A direita, quimiotripsina e a inibição pela TPCK (notar a similaridade do inibidor com o substrato da enzima) 2

22 Inibidores Reversíveis
Semelhança estrutural entre S e I Não há semelhança estrutural entre S e I Os inibidores reversíveis podem ser de tipos diferentes: Competitivos: semelhança estrutural entre S e I, competem pelo mesmo sítio na enzima Incompetitivos: não há semelhança estrutural entre S e I. Não competem pelo sítio ativo. O I se liga a enzima em outro sítio, após a ligação do S, ou seja, se liga ao complexo ES Mistos: combinação dos dois tipos de inibição anteriores. O inibidor se liga em outro sítio, mas isso pode acontecer antes ou após a formação do complexo ES. Assim, a ligação do I antes do S afeta a ligação do substrato a enzima e vice-versa. Não há semelhança estrutural entre S e I

23 Inibidor não competitivo
Inibidor competitivo Estrutura semelhante à do substrato Liga-se ao Sítio Ativo da enzima Aumento da [substrato] diminui a inibição A Vmax NÃO se altera Km da enzima AUMENTA na presença do inibidor Inibidor não competitivo Não tem estrutura semelhante à do substrato Não se liga ao Sítio Ativo da enzima Aumento da [substrato] não diminui a inibição A Vmax diminui na presença do inibidor altera Km da enzima não se altera Comparação entre um inibidor competitivo e um não competitivo Muito importante: Competitivo: aumento do substrato diminui a inibição da enzima, o que não ocorre no não competitivo pois o substrato não desloca o inibidor nesse último caso A Vmax não se altera na inibição competitiva (demora mais para ser atingida) mas diminui na não competitiva. A enzima inibida não consegue chegar no Vmax original. O Km aumenta na competitiva devido a competição entre S e I mas não se altera na não competitiva, pois nesse caso I não influencia a ligação de S a enzima.

24 Inibição Competitiva Gráfico de inibição competitiva
Ex.: Inibição da Succinato Desidrogenase (Malonato) - Malonato possui estrutura similar ao substrato da enzima, fumarato. - Observar que na presença do inibidor a Vmax não se altera. Em ambos os casos atinge 13,5 mmol/min - Entretanto, demora mais para se chegar nessa velocidade com I do que sem, o que é refletido pela dimuição da afinidade da enzima pelo substrato (aumento do Km)

25 Inibição Competitiva Inibição Não-Competitiva
Representação dois tipos de inibição, competitiva e não competitiva no gráfico hiperbólico e no duplo recíproco No gráfico hiperbólico podemos ver que o Km aumenta mas a velocidade não se altera, quando da inibição competitiva. Já na inibição não competitiva vemos que a Vmax diminui mas o Km não se altera Nos gráficos de duplo recíproco podemos ver a mesma coisa, mas de maneira simplificada A esquerda, na inibiçao competitiva, vemos que a Vmax não se altera (eixo y), mas o Km aumenta (eixo x) conforme acrescentamos inibidor. A direita, vemos que o Km se mantem constante mas Vm diminui a medida que acrescentamos o inibidor. Lembrar que no duplo recíproco os valores estão invertidos.

26 Inibição Incompetitiva
O inibidor se liga somente no complexo ES, em sítio próprio Na inibição incompetitiva, o inibidor se liga somente ao complexo ES, em sítio próprio. Como o acréscimo de substrato não desloca o inibidor, o Km aumenta. Com menos enzima ativa, a Vmax diminui. Mostrado tanto no gráfico hiperbólico quanto no duplo recíproco

27 Analgésicos – Inibidores de Prostaglandinas
Ligação covalente Inibidor irreversível (suicida) - Aspirina Interações sem ligação covalente Inibidor competitivo e reversível – Ponstan Mecanismo de ação dos analgésicos – inibição de prostaglandinas (importantes mediadores inflamatórios derivados do ácido aracdônico) - Aspirina (ácido acetilsalicílico) – inibidor irreversível das ciclooxigenases (prostaglandina H sintetase) - Ponstan – ácido mefalêmico (muito utilizado contra cólica menstrual) – inibe reversivelmente as ciclooxigenases

28 Regulação de perfusão renal Agregação plaquetária
Protetora de mucosa gástrica Inflamação COX-1 é constitutiva, expressa em diversos tecidos em condições fisiológicas COX-2 já é indetectável na maioria dos tecidos, é indutível, sendo abundante em macrófagos ativados e outras células no local da inflamação

29 Sítio Ativo da COX

30 Inibidor competitivo e reversível da COX-1/2 Interação iônica
Dipirona sódica Inibidor competitivo e reversível da COX-2 Meloxicam

31 Inibidores de Proteases do HIV
Gag e Pol são clivados pela protease do HIV em 9 pontos específicos para produzir proteínas funcionais. O precursor Gag vai originar proteínas estruturais O precursor Pol vai originar enzimas como transcriptase reversa, integrase e proteases. Amprenavir Dois genes, gag e pol, não são transcritos em proteínas individuais. Na verdade, são transcritos como um único segmento que é clivado por uma protease do tipo 1 específica do vírus Esta protease é um homodímero, sendo cada subunidade composta de 99 aminoácidos O amprenavir é um inibidor competitivo da protease do tipo 1 do HIV

32 Ciclo de replicação do HIV
A inibição da protease para o ciclo de replicação do vírus, o que melhora a sobrevida do paciente infectado.

33 Enzimas Alostéricas Sistema multienzimático sequencial
No metabolismo celular, grupos de enzimas trabalham em conjunto, formando vias sequencias para desenvolver um dado processo metabólico. Nesses sistemas enzimáticos, o produto da primeira reação só tem um destino, ser substrato da enzima subsequente, e assim por diante. A maioria das enzimas segue os parâmetros cinéticos já descritos. Entretanto, em cada sistema enzimático existe uma enzima pelo menos que determina a velocidade de toda a sequência, porque ela catalisa a reação mais lenta ou a reação limitante da velocidade. Estas enzimas reguladoras tem sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais Existem duas grandes classes de enzimas reguladoras: alostéricas e reguladas por modificação covalente reversível. Último produto da via inibindo a primeira enzima, inibição retroativo.

34 Enzimas Alostéricas Analogia com proteínas alostéricas: Hemoglobina
Moduladores alostéricos (≠ de inibidores não-competitivos ou mistos!!) Mudanças conformacionais entre forma ativa e inativa e parâmetros cinéticos diferentes (≠ do Michaelis-Menten) Homotrópicas ou heterotrópicas Hemoglobina – ligação do O2 muda a conformação da proteína, facilitando a ligação dos próximos O2 (ligação cooperativa). São enzimas que funcionam através da ligação não-covalente e reversível de moduladores. Os parâmetros cinéticos são diferentes, não seguem o modelo de Michaelis-Menten, formando curvas sigmóides Podem ser homotrópicas, nas quais o substrato e o modulador são idênticos, ou heterotrópicas, quando o modulador é diferente do substrato.

35 Enzimas Alostéricas Reguladas por moduladores alostéricos → envolvendo ou não o sítio ativo Várias subunidades Inibição por retroalimentação Exemplo: Aspartato transcarbamilase 12 cadeias polipeptídicas Azul: catalítica Vermelho/Amarela: regulatórias Resumo, Enzimas alostéricas são reguladas por moduladores alostéricos. Possuem várias subunidades, catalíticas e reguladoras Inibidas por retroalimentação Exemplo da Aspartato transcarbamilase: enzima contem 12 subunidades, 4 catalíticas e 8 regulatórias.

36 Aspartato Transcarbamilase
Síntese de pirimidinas Catalisa a primeira reação na síntese das pirimidinas Possui sítios de ligação para os nucleotídeos trifosfatados ATP, CTP e UTP O ATP se liga a um sítio que aumenta a atividade da enzima, enquanto que o CTP se liga a um sítio de inibição da atividade

37 Modulador Alostérico Pode ser tanto um inibidor quanto um ativador.
Moduladores alostéricos podem ser tanto ativadores quanto inibidores, como no caso da ATCase

38 Michaelis-Menten Enzimas Alostéricas Enzima Homotrópica
Efeito moduladores Gráficos comparativos da cinética clássica de Michaelis-Menten e das enzimas alostéricas. A esquerda, enzima homotrópica, pequeno aumento de S aumenta mais a Vo. Faz sentido, terá mais substrato para ligar no sítio alostérico, o que ativa mais a enzima. A esquerda, efeitos de moduladores positivos e negativos. Percebe-se alteração do Km mas não da velocidade da reação Em baixo, um tipo menos comum de modulação, nela a Vmax é modulada enquanto o Km permanece constante.

39 Exemplos de Enzimas Regulatórias
PFK-1 Fosfofrutoquinase-1 ou PFK-1 é uma enzima regulatória da via glicolítica Catalisa a fosforilação da frutos-6-fosfato gerando frutose-1,6-bifosfato Moduladores positivos e negativos

40 Modificação Covalente Reversível

41 Exemplos de Enzimas Regulatórias
Glicogênio Fosforilase Glicogênio Fosforilase ocorre em duas formas: a, forma ativa e b, relativamente inativa. A fosforilase a tem duas subunidades, cada uma delas com um resíduo de serina específico que é fosforilado em seu grupo hidroxila. Esses resíduos de serina-fosfato são requeridos para a atividade máxima da enzima

42 Ativação Proteolítica

43 Fatores que afetam a Velocidade Enzimática
pH Temperatura Concentração de substratos Concentração de cofatores Presença de Inibidores e/ou ativadores Modificações químicas: fosforilações, adenilações, etc Concentração de enzima