Elementos de Microscopia e Microanálise

Apresentação em tema: "Elementos de Microscopia e Microanálise"— Transcrição da apresentação:

1 Elementos de Microscopia e Microanálise
Docente: Profª Drª Maria Tercília V. A. Oliveira Discente: Bruna Victorasso Jardim

2 CULTURA CELULAR

3 Definição Conjunto de técnicas que permitem cultivar células fora do organismo dadas as condições apropriadas Humanos Animais Vegetais Tecidos IN VITRO X IN VIVO

4 Histórico Cultivou células de embrião de aves e, solução salina aquecida Wilhen Roux Pioneiro no cultivo celular de animais Ross Harrison

5 Hipótese Doutrina do neurônio
Origem do axônio - cada fibra nervosa é o produto de uma única célula nervosa e não da fusão de várias. fragmentos de tecido da medula espinhal de anfíbios linfas coaguladas como meio de cultura armazenadas em câmara úmida e morna microscópio – intervalos regulares de tempo células nervosas individuais com um axônio cada Base para a cultura celular

6 1ª limitação Burrows – 1910 Alexis Carrel Rous e Jones - 1916
Desenvolvimento de meios nutritivos Burrows – 1910 Plasma de aves  nutrir explantes de tec. embrionário Subculturas para prolongar a vida das células utilizando meio nutritivo Plasma Extratos de embrião Alexis Carrel Rous e Jones Tripsina para dissociar células embrionárias

7 2ª Limitação Contaminação Avanços com alguns destaques
Desenvolvimento de condições assépticas - Cultivou células de embrião de aves por + de 30 anos Células dividiam indefinidamente  extrato de embrião de galinha Alexis Carrel 1940 - Surgimento dos antibióticos Avanços com alguns destaques

8 1ª linha celular contínua
Células epiteliais humanas procedentes de carcinoma cervical células HeLa George Gey - Utilizou meios indefinidos e complexos Plasma de aves Extrato de embrião bovino Cordão umbilical humano Dificuldade para analisar a composição específica para cada tipo celular se desenvolver e funcionar normalmente

9 Células cultivadas em condições experimentais definidas
Fator de crescimento nervoso estimula o crescimento dos axónios em cultura de tecidos Stanley Cohen Harry Eagle – 1955 Investigou os requerimentos nutritivos das células em cultivo Sais Glicose AminoácidosVitaminas Células cultivadas em condições experimentais definidas + Soro de proteínas

10 Meio Basal de Eagle (BME)  aa essencias
Meio Mínimo Essencial de Eagle (MEM)  + aa Meio MEM modificado por Dulbecco (DMEM)  4x + aa Soro fetal bovino

11 Células morrem após um número finito de divisões em cultura
Leonard Hayflick e Paul Moorhead Fibroblastos jovens Fibroblastos velhos

12 Possibilitou o estudo de moléculas sinalizadoras extracelulares
Ham -1965 1º meio livre de soro capaz de manter algumas células de mamíferos em cultivo quimicamente definido Sais Glicose Vitaminas Aminoácidos Pequenas moléculas Proteínas específicas Possibilitou o estudo de moléculas sinalizadoras extracelulares Sobreviver e proliferar Fatores de crescimento Transferrina Essenciais para sobrevivência, desenvolvimento e proliferação de tipos de células específicos

13 Harris e Watkins 1º heterocário de células de mamíferos pela fusão Humano Camundongo Mitose  crs. no mesmo núcleo  células híbridas Linhagens com composição cromossômica = Localizar genes no genoma e banco de DNA de crs. específicos = +

14 + Augusti- Tocco e Sato - 1969 1975
1ª linhagem celular estável a partir de uma célula tumoral de nefroblastoma de camumdongo  eletricamente excitáveis 1975 1ª linhagem celular produtora de anticorpos monoclonais hibridomas Linfócitos B do baço com antígeno do anticorpo desejado inoculado Células de mieloma que se reproduzem em cultura indefinitamente + Cesar Milstein Células produzindo o anticorpo desejado George Kohler

15 Hayashi e Sato – 1976 Trabalhos demonstrando: = linhagens celulares = misturas de hormônios e fatores de crescimento Células crescerem em meios livres de soro 1977 1º introduzir genes de cópias únicas de mamíferos in vitro Gene que codifica a enzima timidina quinase em células com esse gene deficiente Michael Wigler Avanço na cultura celular pela possibilidade de produzir proteínas terapêuticas em grande escala Richard Axel

16 Isolou e cultivou células totipotentes de ratos
Martin Evans -1986 Isolou e cultivou células totipotentes de ratos James Thomson e John Gearhart – 1998 Isolaram e mantiveram vivas in vitro células embrionárias humanas

17 Bactéria X Células de tecido Células Cultivadas em superfície sólida
Cultivadas em suspensão Duplicação em 30 min. Duplicação em hrs Células Componentes específicos da Matriz Extracelular Colágeno Laminina

18 Tipos de cultura celular
Cultura primária – preparada diretamente do tecido de um organismo, com ou sem fracionamento inicial das células Cultura secundária – a partir de células retiradas da placa de cultura primária Subcultivos Promove nova fonte de nutrientes e espaço para o crescimento contínuo de linhagens celulares

19 Linhagem de células linhagem de células
Células morrem após um nº finito de divisões em cultura Mutação  Células imortais – proliferam indefinidamente linhagem de células Podem ser armazenadas em N líquido e continuarem viáveis

20 Linhagem de células podem ser preparadas a partir de células de câncer
Proliferam-se em altas densidades Crescem sem se fixarem a uma superfície Linhagem de células normais transformadas Substâncias químicas Vírus indutor Linhagens celulares são importantes na pesquisa celular  alta quantidade de células de um determinado tipo Não são idênticas

21 Clonagem celular Células geneticamente idênticas
Uma célula isolada origina a cultura Células geneticamente idênticas Importância = linhagens de células mutantes com defeito em um gene específico Função da proteína em células normais

22 Aplicações Reproduzir fenômenos que ocorrem in vivo mas que são inacessíveis adicionar ou remover moléculas específicas Estudo da fisiologia e metabolismo de células específicas Estudar interações entre vários tipos de células – culturas mistas Estudo de neoplasias Testar drogas ou compostos químicos Possibilidade de gerar tecidos artificiais Produção de proteínas terapêuticas

23 Vantagens Desvantagens Reprodutibilidade dos resultados
Linhagem de células clonais Controle das condições ambientais Possibilidade de selecionar uma população de células específicas Conhecimento do comportamento e função das células selecionadas Desvantagens Perda das características – cultivo longo Necessidade de marcadores Confiabilidade dos resultados in vivo – ex: drogas Contaminação

24 Cuidados Biossegurança Sala separada especial
Esterilizar todos os materiais e equipamentos com álcool 70 Luz UV Usar: luvas estéreis, máscara... Não reutilizar materiais Material biológico  lixo separado

25 Protocolo para cultivo celular
Cultivo de celulas de câncer de mama Biopsia do tecido meio de congelamento  meio de cultura + DMSO + antibiótico 2 horas em geladeira 30 min a 5 cm do N liquido (p congelar aos poucos) armazenar em N Liquido

26 Protocolo para cultivo celular
Cultivo de células de câncer de mama Biópsia do tecido Coletada e armazenada em meio de transporte - 100 ml meio RPMI - 1 ml de antibiótico 3 ml -Tubo falcon                            Preparação inicial limpeza com álcool e UV 20 min Meio de cultura, PBS, tripsina – banho maria a 37ºC

27 Preparo do meio de cultura
20 ml soro fetal bovino 1 ml antibiótico/antimicótico 1 ml L-glutamina 100 ml de meio de cultura RPMI 1640

28 Processamento do fragmento tumoral
Lavar o tumor com PBS (4x – 2 min) Tesoura ou bisturi 1 ml de meio RPMI 1640 no frasco T-25 Estufa 37ºC – 5% CO2

29 1 ou 2 dias depois adicionar 1ml de meio lentamente para não soltar as células
Trocar o meio de cultura a cada 2 dias Retirar o meio com a pipeta 4ml de meio – frasco T-25 8 ml de meio – frasco T-75 O meio deve ser descartado com hipoclororito Subculturas Retirar o meio de cultura Lavar com PBS 1X Retirar o PBS Adicionar 2 ml de tripsina Aguardar 4 –10 min o desprendimento das células Passar todo conteúdo do frasco para outro frasco Adicionar 2 ml de meio de cultura Colocar na estufa 37ºC – 5% CO2

30 Capela de fluxo para cultura celular
Placa six-wells

31 Congelamento de células
Tripsinizar Colocar em tubo falcon Centrifugar a 1600 rpm – 5 min Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 900 ul de meio e 100 ul de DMSO Passar para criotubo Geladeira por 30 min Frezeer – 80ºC – 24 hrs Nitrogênio líquido

32 Descongelamento das células
Retirar o criotubo do N líquido Banho maria a 37ºC – 90 seg. Transferir para tubo falcon 15ml contendo: 10 ml de meio Centrifugar – 5min Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em meio de cultura Transferir para frasco T-25 Estufa

33 Invertoscópio

34 4x

35 10x

36 10

37 40x

38 Fungo 4x e 10x

39 Obrigada