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Controle - e descontrole - do Ciclo Celular As três vertentes: 1. Os fãs do Pink Floyd, que acreditavam que a chave estava nas vias disparadas pelos 10%

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2 Controle - e descontrole - do Ciclo Celular As três vertentes: 1. Os fãs do Pink Floyd, que acreditavam que a chave estava nas vias disparadas pelos 10% de soro fetal 2. Os caçadores de galinhas, que procuravam por oncogenes inseridos em retrovírus tumoral 3. Os enfurnados nos laboratórios estudando levedura e rãs, que não têm cancer, e descobriram o relógio

3 Vertente 1, das células 3T3 Meio de cultura –Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) sais, aminoácidos, vitaminas, glicose tampão bicarbonato/ác. carbônico pH 7 em 5% CO 2 ou sal de fruta ENNO, caixa Tupperware e esponja –Soro fetal bovino 10% v/v, seria o que uma célula veria Cultilab (Campinas) SORO x PLASMA: o que corre nos vasos? –PDGF: importante fator plaquetário do soro

4 Só vou repicar umas células... Lavar 2x com PBS Adicionar 1 mL de tripsina em PBS EDTA Deixar filme de tripsina Ressuspender em meio com soro –o soro inativa a tripsina –subcultivar com diluição (1/4, 1/6...) Anotar o número da passagem no frasco

5 Fibroblastos: modelo de estudo Célula normal = inibição por contato –cresce até a confluência ou monocamada –pára de se dividir com conteúdo de DNA de G1 –motivo: p27 bloqueia quinases reguladoras das etapas do ciclo, exceto a da mitose –células ficam quiescentes, mas não como Go Célula tumoral: perde inibição por contato –empilha = focos de transformação –ensaio: nº de placas com foco (+TPA ou PMA)

6 Descobrindo quanto se vai viver Pedaço de tecido –embrião ou braço + pinça + tesoura –colonização da superfície da placa = cultura primária (geralmente fibroblastos) –crise: cerca de 100 passagens se o doador for jovem e morte da cultura por senescência –protocolos iniciais: quase sempre resultavam em células transformadas (empilhavam) –protocolo 3T3 ou 10T1/2: imortais normais (repiques feitos sem adimitir confluência)

7 Fases do ciclo de divisão celular Dois eventos visíveis –M= células redondas e bi-refringentes –S = incorporação de Timidina tritiada ou BrdU Dois vãos ou gaps –G1, antes de S (DNA = 2C) –G2, depois de S (DNA = 4C) Detecção de proliferação –FACS, incorporação de BrdU ou índice mitótico Células quiescentes = estado G zero (Go)

8 Duração do ciclo Variações de G1 –G1 é ausente em embriões (não em mamíferos) até a midi-blástula –Variável, porque soma-se a paradas intermitentes em Go Variações de S –curta em embriões (não em mamíferos) uso de maior número de origens de replicação Determinação do tempo de dobramento –curva de crescimento em plote logarítmico

9 Sincronização das células Todas na mesma fase do ciclo –Mitotic Shake-off (destacamento mitótico) Nocodazole 50 ng/ml por 4 horas (<100% em M) BANG, BANG, BANG –Carenciamento para soro (24 h) células mais jovens que meio G1 páram (G1pm) células mais velhas que meio G1 ciclam (G1ps) ao final das 24 h, todas se acumulam em Go demoram o dobro de G1 para percorrer Go/G1 –Afidicolina (inibe Pol. alfa): bloqueio em fase S

10 Lesões em DNA Quebras em cadeias de DNA –sedimentação em gradiente de sacarose –desnaturação alcalina suave (Bihrimboin) –eluição alcalina –relaxamento de nucleóides Quantificação das modificações químicas Inibição de síntese de DNA –taxa de incorporação de timidina tritiada –velocidade de crescimento da cadeia de DNA

11 Sobrevivência celular Letalidade é um evento raro Segue distribuição de Poisson Classe Zero de Poisson –quando a média de eventos letais é de 1 por célula –37% das células sobrevivem Ombro da curva de sobrevivência –indica capacidade de suportar lesões –por reparo ou pouca genotoxicidade

12 Muitas lesões? Pode ser disparada a apoptose –morte celular programada –diferente de necrose –iniciada por proteólise limitada mediada por caspases –envolve ação de nucleases que atacam o DNA Bloqueios de ciclo celular evitam apoptose –permitem tempo de reparo –mecanismos de checagem ou checkpoints

13 Instabilidade genômica Câncer = pelo menos 4 mutações –incompatível com ocorrência ao acaso –necessário instabilidade genômica Mutações –reguladores do próprio ciclo celular –positivos = protoncogenes (vírus RNA animal) –negativos = supressores de tumor (vírus DNA) Afetam o relógio do ciclo celular –quinases dependentes de ciclinas

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15 v-sis pessoas BPV E5 pessoas v-Erb-B pessoas EJ-ras pessoas v-Ha-ras pessoas v-src pessoas HPV E6 pessoas HPV E7 pessoas SV40 Large T pessoas v-fos pessoas v-jun pessoas c-myc pessoas


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