High Performance Liquid Chromatography

Apresentação em tema: "High Performance Liquid Chromatography"— Transcrição da apresentação:

1 High Performance Liquid Chromatography
HPLC High Performance Liquid Chromatography CLAE Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência

2 1. Introdução CROMATOGRAFIA = método físico de separação no qual os constituintes de uma amostra a serem separados são distribuídos entre 2 fases: estacionária: geralmente de grande área, sólida ou líquida móvel: um fluido insolúvel que percola através da primeira

3 FASE MÓVEL injeção separação eluição Fase estacionária DETECTOR

4 CROMATOGRAFIA SFC LC GC Cromatografia a Cromatografia a
Fluido Supercrítico Líquido Gás LC LC Planar Coluna CCD Coluna "Open Cromatografia Coluna Cromatografia Tubular" Capilar Papel Empacotada Camada Delgada d c < 350 um Coluna Capilar Coluna Coluna Coluna empacotada Microbore "Analítica" Preparativa d c <= 350 um 350 um < d c < 1 mm 1 mm < d c < 8 mm d c >= 8 mm FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.

5 LC Clássica Fluxo por gravidade

6 HPLC Moderna* Partículas da fase estacionária extremamente pequenas (diâmetro < 10 m)  bombas para operações a altas pressões (até 500 atm) e baixas vazões (0,01 a 2-3 mL / min) High Pressure LC Solventes especiais e ultra-puros Detectores seletivos e super-sensíveis, com tamanho de célula de detecção < 10 L

7 HPLC Moderna* Reservatórios para os solventes Injetor Precoluna
Detector Sistema de Tratamento de Dados Bomba HPLC Injetor Precoluna Coluna Analitica Filtro em linha Scavenger Reservatórios para os solventes

8 Substâncias não analisáveis por GC:
compostos iônicos sais inorgânicos e orgânicos aminoácidos puros compostos polares de alto PM polímeros compostos termicamente instáveis corantes salinos etc.

9 Aplicações HPLC Substâncias químicas
Proteínas Ácidos nucleicos Aminoácidos Corantes Polissacarídeos Pigmentos plantas Metabólitos plantas Produtos farmacêuticos Compostos iônicos Íons metálicos Cátions e ânions Lipídeos polares Complexos metais pesados Explosivos Polímeros sintéticos

10 Vantagens da HPLC Sensível a diversas amostras, incluindo orgânicas, biomoléculas e íons - Pode-se analisar > 60% de todos os componentes contra uns 15% para GC Alta resolução resolve (separa) centenas de componentes em amostras complexas Detecção de alta sensibilidade detecta nos limites de pg - ng Análises rápidas e precisas análises de min, precição de 1% RSD Análises automatizadas usando autosampler e sistema de tratamento de dados

11 4. Modos de Separação Cromatografia de adsorção (sólido-líquido)
Cromatografia de partição (líquido-líquido) Cromatografia de troca iônica Cromatografia por exclusão de tamanho

12 Fase Estacionária Sólida
Apresenta na superfície cargas iônicas ou polares. Exemplos: Sílica gel Alumina Florisil Carvão Carbonato de cálcio

13 Fase Móvel Hexano Isooctano Cloreto de butila Clorofórmio
Diclorometano Tetraidrofurano Acetonitrila Iso e n-propanol Metanol Água

14 Cromatografia de Adsorção
apolar Fluxo

15 Cromatografia de partição clássica
FASE ESTACIONÁRIA Fina camada de líquido que cobre as partículas de um suporte sólido Este líquido pode ser: polar: polietilenoglicol, ODPN (, ´-oxidipropionitrila) apolar: hexano FASE MÓVEL Sempre de polaridade contrária Baixa estabilidade

16 Cromatografia de partição com fases quimicamente ligadas
FASE ESTACIONÁRIA Líquido é quimicamente ligado ao suporte sólido. FASE MÓVEL Sempre de polaridade contrária Alta estabilidade

17 Fases polares quimicamente ligadas frequentemente utilizadas
MODO GRUPO FUNCIONAL ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO Amino NH2 Ciano (nitrila) CN FASE NORMAL Diol Si O CH2 CH CH2OH OH

18 Fases apolares quimicamente ligadas freqüentemente utilizadas
MODO GRUPO FUNCIONAL ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO Dimetil silil Si CH3 Octil silil Si CH2 (CH2)6 CH3 FASE REVERSA Octadecil silil Si CH2 (CH2)16 CH3 Fenil silil Si OH

19 Cromatografia de Partição
apolar Fluxo polar

20 Cromatografia Fase Normal (NPC) x Cromatografia Fase Reversa (RPC)
Classificação baseada na Natureza da Fase Móvel NPC Fase móvel Apolar  hexano, isooctano Fase estacionária Polar  sílica, alumina RPC Fase móvel Polar  metanol, água Fase estacionária Apolar  C8, C18

21 Portanto.......... GERALMENTE: NPC  Cromatografia Adsorção
RPC  Cromatografia Partição

22 4.3. Cromatografia de troca iônica
FASE ESTACIONÁRIA = grupos iônicos quimicamente ligados a um suporte (sílica ou polímeros de alto PM). Pode ser: trocadora de cátions: grupo iônico = sulfonato trocadora de ânions: grupo iônico = amônia quaternária FASE MÓVEL = soluções tampões (controle pH). Por exemplo: ácido cítrico, fosfato amônia, acetato sódio, borato sódio, etc. APLICAÇÕES = compostos iônicos, aminoácidos, proteínas/peptídeos, etc

23 Cromatografia de troca iônica
+ - SO Na 3 pH Suporte Polimérico ou de Silica Fluxo

24 4.4. Cromatografia por exclusão de tamanho
A separação é baseada no tamanho da molécula e não em fenômenos de interações físicas ou químicas FASE ESTACIONÁRIA = partículas com diâmetro médio de poro fabricado sob medida. Assim, algumas moléculas (menores) podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros médios, ou seja, são permeadas seletivamente. As moléculas grandes são excluídas  exclusão tamanho.

25 Cromatografia por exclusão de tamanho
FLUXO Poro Gel

26 Resolução (Rs) Rs = tr1 - tr2 / wb Rs = separação real dos picos
Rs = 0 (sem separação), Rs = 1 (separação parcial), Rs = 1.5 (separação da linha base) Injeção W t

27 1. Colunas Sistema separação (adsorção, partição, etc)
Comprimento (10-25 cm) cromatografia rápida  3 cm Diâmetro interno* Tipo de suporte (sílica gel ou polímeros) Grupos quimicamente ligados (amino, ciano, C8, C18, sulfonato) Tamanho da partícula (3-20 m) Tamanho do poro ( Å)

28 Diâmetro da coluna Tipo de Coluna i.d. (mm) Capacidade de amostra (mg)
Velocidade de Fluxo ( mL/min) Semi-preparativa 8-20 10-50 5-30 Analítica 4.6 1 Narrowbore 2.0 0.2 Microbore 1.0 0.05

29 2. Bombas / Fase Móvel Velocidade fluxo Pressão operação
0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas > 5,0 mL/min para colunas preparativas Pressão operação psi para colunas analíticas

30 Eluição Isocrática / Gradiente
ISOCRÁTICA = a composição da fase móvel não muda durante a corrida. GRADIENTE = a composição da fase móvel varia de acordo com a polaridade dos analitos. Bomba binária/quaternária.

31 3. Injeção da Amostra INJETOR MANUAL Da Da bomba bomba Amostra
Loop Da bomba Para coluna Amostra da seringa Da bomba Para coluna Descarte Loop

32 3. Injeção da Amostra AUTOSAMPLER Corpo Solvente da Seringa Amostragem
Válvula de injeção Frasco de lavagem Vials na bandeja

33 4. Detectores Equipamento com uma pequena célula de fluxo conectado na saída da coluna e que monitora a concentração dos analitos. Detectores mais comuns: UV/Vis (absorvância) Fluorescência Índice de Refração Outros: Eletroquímico, Condutividade, Infravermelho, etc.

34 4.1. Detectores UV/Vis e Rede de Diodos (DAD)
PRINCÍPIO: quando vários grupos funcionais são expostos à radiação, sofrem excitação eletrônica a qual resulta na absorção de energia em comprimentos de onda específicos para os grupos. Comprimento onda: nm  UV Comprimento onda: nm  Visível  90% compostos orgânicos absorvem luz em algum lugar da região UV-Vis  65% das amostras analisadas por LC absorvem luz na região de compr. Onda = 254 nm

35 Detector de Absorvância UV/Vis

36 Detector de Rede de Diodos (DAD)

37 4.2. Detectores de Fluorescência
Detectam compostos com fluorescência natural (aflatoxinas) ou que se tornam fluorescentes após reação de derivação (cloreto dansyl, fluoresceína, OPA)

38 4.3. Detectores de Índice de Refração (IR)
PRINCÍPIO: mede a mudança do índice de refração dos efluentes das colunas IR : característica física de cada composto IR da substância analisada  IR da fase móvel Análise isocrática, controle temperatura Detector universal, não seletivo e pouco sensível Aplicações: separações preparativas, cromatografia polímeros (exclusão tamanho), açúcares, etc.

39 Detector de Índice de Refração (IR)

40 Detectores SENSIBILIDADE ESPECIFICIDADE
Fluorescência: vezes mais sensível que UV-Vis UV-Vis: vezes mais sensível que IR ESPECIFICIDADE Aumenta com a sensibilidade

41 FIM !!!!!!!!!