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High Performance Liquid Chromatography CLAE Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência HPLC.

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Apresentação em tema: "High Performance Liquid Chromatography CLAE Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência HPLC."— Transcrição da apresentação:

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2 High Performance Liquid Chromatography CLAE Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência HPLC

3 1. Introdução CROMATOGRAFIA = método físico de separação no qual os constituintes de uma amostra a serem separados são distribuídos entre 2 fases: estacionária estacionária: geralmente de grande área, sólida ou líquida móvel: um fluido insolúvel que percola através da primeira

4 FASE MÓVEL injeçãoseparaçãoeluição Fase estacionária DETECTOR

5 FONTE: LOUGH & WAINER, LC Cromatografia a Líquido SFC Cromatografia a Fluido Supercrítico GC Cromatografia a Gás LC Planar LC Coluna Cromatografia Papel CCD Cromatografia Camada Delgada Coluna Empacotada Coluna "Open Tubular" Capilar d c < 350 um Coluna Capilar empacotada d c <= 350 um Coluna Microbore 350 um < d c < 1 mm Coluna "Analítica" 1 mm < d c < 8 mm Coluna Preparativa d c >= 8 mm CROMATOGRAFIA

6 LC Clássica Fluxo por gravidade

7 HPLC Moderna* Partículas da fase estacionária extremamente pequenas (diâmetro < 10 m) bombas para operações a altas pressões (até 500 atm) e baixas vazões (0,01 a 2-3 mL / min) High Pressure LC Solventes especiais e ultra-puros Detectores seletivos e super-sensíveis, com tamanho de célula de detecção < 10 L

8 Detector Sistema de Tratamento de Dados Bomba HPLC Injetor Precoluna Coluna Analitica Filtro em linha Scavenger Reservatórios para os solventes HPLC Moderna*

9 Substâncias não analisáveis por GC: compostos iônicos sais inorgânicos e orgânicos aminoácidos puros compostos polares de alto PM polímeros compostos termicamente instáveis corantes salinos etc.

10 Aplicações HPLC Substâncias químicas Proteínas Ácidos nucleicos Aminoácidos Corantes Polissacarídeos Pigmentos plantas Metabólitos plantas Produtos farmacêuticos Compostos iônicos Íons metálicos Cátions e ânions Lipídeos polares Complexos metais pesados Explosivos Polímeros sintéticos

11 Vantagens da HPLC Sensível a diversas amostras, incluindo orgânicas, biomoléculas e íons - Pode-se analisar > 60% de todos os componentes contra uns 15% para GC Alta resolução resolve (separa) centenas de componentes em amostras complexas Detecção de alta sensibilidade detecta nos limites de pg - ng Análises rápidas e precisas análises de min, precição de 1% RSD Análises automatizadas usando autosampler e sistema de tratamento de dados

12 4. Modos de Separação Cromatografia de adsorção (sólido-líquido) Cromatografia de partição (líquido-líquido) Cromatografia de troca iônica Cromatografia por exclusão de tamanho

13 Sólida Apresenta na superfície cargas iônicas ou polares. Exemplos: Sílica gel Alumina Florisil Carvão Carbonato de cálcio Fase Estacionária

14 Hexano Isooctano Cloreto de butila Clorofórmio Diclorometano Tetraidrofurano Acetonitrila Iso e n-propanol Metanol Água Fase Móvel

15 Cromatografia de Adsorção apolar Fluxo

16 FASE ESTACIONÁRIA Fina camada de líquido que cobre as partículas de um suporte sólido Este líquido pode ser: polar: polietilenoglicol, ODPN (, ´-oxidipropionitrila) apolar: hexano FASE MÓVEL Sempre de polaridade contrária Baixa estabilidade Cromatografia de partição clássica

17 FASE ESTACIONÁRIA Líquido é quimicamente ligado ao suporte sólido. FASE MÓVEL Sempre de polaridade contrária Alta estabilidade Cromatografia de partição com fases quimicamente ligadas

18 Fases polares quimicamente ligadas frequentemente utilizadas MODO GRUPO FUNCIONAL ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO Amino NH 2 Ciano (nitrila)CN Diol SiOCH 2 CHCH 2 OH OHO SiOCH 2 CHCH 2 OH OHO FASE NORMAL

19 Fases apolares quimicamente ligadas freqüentemente utilizadas MODO GRUPO FUNCIONAL ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO FASE REVERSA Dimetil sililSi CH 3 Octil sililSiCH 2 (CH 2 ) 6 CH 3 Octadecil sililSiCH 2 (CH 2 ) 16 CH 3 Fenil sililSiOH

20 Cromatografia de Partição apolar Fluxo polar

21 Classificação baseada na Natureza da Fase Móvel NPC Fase móvel Apolar hexano, isooctano Fase estacionária Polar sílica, alumina RPC Fase móvel Polar metanol, água Fase estacionária Apolar C8, C18 Cromatografia Fase Normal (NPC) x Cromatografia Fase Reversa (RPC)

22 GERALMENTE: NPC Cromatografia Adsorção RPC Cromatografia Partição Portanto

23 4.3. Cromatografia de troca iônica FASE ESTACIONÁRIA = grupos iônicos quimicamente ligados a um suporte (sílica ou polímeros de alto PM). Pode ser: trocadora de cátions: grupo iônico = sulfonato trocadora de ânions: grupo iônico = amônia quaternária FASE MÓVEL = soluções tampões (controle pH). Por exemplo: ácido cítrico, fosfato amônia, acetato sódio, borato sódio, etc. APLICAÇÕES = compostos iônicos, aminoácidos, proteínas/peptídeos, etc

24 Cromatografia de troca iônica + - SO Na pH Suporte Polimérico ou de Silica - Fluxo

25 4.4. Cromatografia por exclusão de tamanho A separação é baseada no tamanho da molécula e não em fenômenos de interações físicas ou químicas FASE ESTACIONÁRIA = partículas com diâmetro médio de poro fabricado sob medida. Assim, algumas moléculas (menores) podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros médios, ou seja, são permeadas seletivamente. As moléculas grandes são excluídas exclusão tamanho.

26 Cromatografia por exclusão de tamanho FLUXO Poro Gel

27 Resolução (Rs Resolução (Rs ) Rs = t r1 - t r2 / w b Rs = separação real dos picos Rs = 0 (sem separação), Rs = 1 (separação parcial), Rs = 1.5 (separação da linha base) Injeção W W t

28 1. Colunas Sistema separação (adsorção, partição, etc) Comprimento (10-25 cm) cromatografia rápida 3 cm Diâmetro interno* Tipo de suporte (sílica gel ou polímeros) Grupos quimicamente ligados (amino, ciano, C8, C18, sulfonato) Tamanho da partícula (3-20 m) Tamanho do poro ( Å)

29 Diâmetro da coluna

30 2. Bombas / Fase Móvel Velocidade fluxo 0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas > 5,0 mL/min para colunas preparativas Pressão operação psi para colunas analíticas

31 Eluição Isocrática / Gradiente ISOCRÁTICA = a composição da fase móvel não muda durante a corrida. GRADIENTE = a composição da fase móvel varia de acordo com a polaridade dos analitos. Bomba binária/quaternária.

32 3. Injeção da Amostra INJETOR MANUAL Amostra da seringa Da bomba Para coluna Descarte Loop Da bomba Para coluna

33 3. Injeção da Amostra AUTOSAMPLER Solvente Corpo da Seringa Amostragem da Seringa Válvula de injeção Frasco de lavagem Vials na bandeja

34 4. Detectores Equipamento com uma pequena célula de fluxo conectado na saída da coluna e que monitora a concentração dos analitos. Detectores mais comuns: UV/Vis (absorvância) Fluorescência Índice de Refração Outros: Eletroquímico, Condutividade, Infravermelho, etc.

35 4.1. Detectores UV/Vis e Rede de Diodos (DAD) PRINCÍPIO: quando vários grupos funcionais são expostos à radiação, sofrem excitação eletrônica a qual resulta na absorção de energia em comprimentos de onda específicos para os grupos. Comprimento onda: nm UV Comprimento onda: nm Visível 90% compostos orgânicos absorvem luz em algum lugar da região UV-Vis 65% das amostras analisadas por LC absorvem luz na região de compr. Onda = 254 nm

36 Detector de Absorvância UV/Vis Detector de Absorvância UV/Vis

37 Detector de Rede de Diodos (DAD) Detector de Rede de Diodos (DAD)

38 4.2. Detectores de Fluorescência Detectam compostos com fluorescência natural (aflatoxinas) ou que se tornam fluorescentes após reação de derivação (cloreto dansyl, fluoresceína, OPA)

39 4.3. Detectores de Índice de Refração (IR) PRINCÍPIO: mede a mudança do índice de refração dos efluentes das colunas IR : característica física de cada composto IR da substância analisada IR da fase móvel Análise isocrática, controle temperatura Detector universal, não seletivo e pouco sensível Aplicações: separações preparativas, cromatografia polímeros (exclusão tamanho), açúcares, etc.

40 Detector de Índice de Refração (IR)

41 Detectores SENSIBILIDADE Fluorescência: vezes mais sensível que UV-Vis UV-Vis: vezes mais sensível que IR ESPECIFICIDADE Aumenta com a sensibilidade

42 FIM !!!!!!!!!


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