Cinética e especificidade enzimática

Apresentação em tema: "Cinética e especificidade enzimática"— Transcrição da apresentação:

1 Cinética e especificidade enzimática
Profa Gabriela Macedo TA 514

2 Velocidade de reação Velocidade = produto formado tempo de reação

3 Velocidade de reação A velocidade de uma reação química, quer seja catalisada ou não, é uma medida da conversão de reagente(s) em produto(s) por unidade de tempo, em condições controladas. Em cinética enzimática os reagentes designam-se substratos. A conversão de um substrato S num produto P, catalisada por um enzima E P Tempo (t) vo reação inicial (mais elevada) reação mais lenta

4 Vmax Se [S] é muito grande, Km torna-se insignificante e v=Vmax
Se [S] = Km V = ½ Vmax V = K[S] ou cinética de primeira ordem quando [S]0,01Km Na prática: tenta-se cinética ordem zero: atividade enzimática diretamente proporcional a concentração da enzima e independe da concentração de substrato. Km depende do pH, temperatura e força iônica do meio Km = mol ou mol de substrato/L Vmax = mol de produto formado/minuto/mg proteína

5 Cinética Enzimática É a parte da enzimologia que estuda a velocidade das reações enzimáticas, e os atores que influenciam nesta velocidade. A cinética de uma enzima é estudada avaliando-se a quantidade de produto formado ou a quantidade de substrato consumido por unidade de tempo de reação

6 Significado de Vmax e Km na cinética de Michaelis-Menten.
S1: maior afinidade S2: menor afinidade KM1 KM2

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8 Equação de Michaelis-Menten
E + S <==> [ES] ==> E + P A partir deste modelo, estes pesquisadores criaram uma equação, que nos permite demonstrar como a velocidade de uma reação varia com a variação da concentração do substrato

9 Equação enzimática Km 1/Vo = . 1 1 + [S] Vmax Vmax

10 Cinética enzimática Esta equação pode ser expressa graficamente, e representa o efeito da concentração de substrato sobre a velocidade de reação enzimática. O Km de um substrato para uma enzima específica é característico, e nos fornece um parâmetro de especificidade deste substrato em relação à enzima. Quanto menor o Km, maior a especificidade, e vice-versa.

11 Cinética: Determinação de Km e Vmax
Se os valores experimentais se ajustarem na curva teórica, o valor de Km pode ser determinado pela fórmula: V = Vmax . [S] Contudo, as reações geralmente são complicadas: Inibição ou ativação pelo substrato em alta concentração ou pela insolubilidade do substrato Km + [S]

12 Determinação de Km e Vmax
Utilização de métodos gráficos: dados transformados em forma linear Valores experimentais de Km e Vmax: obtidos dentro da região do Km teórico Velocidades iniciais: devem ser obtidas em 6 a 10 concentrações do substrato na faixa de 0,1Km a 10Km Bons resultados: 0,3Km a 3Km Tratamento estatístico dos dados (desvio padrão)

13 Métodos Gráficos Lineweaver-Burk V = Vmax . [S] Inverso 1 = Km + 1
A equação é uma reta onde: Y = 1/V, X = 1/[S], b = 1/Vmax,  = Km/Vmax Km + [S] V Vmax[S] Vmax

14 Importância de Km e Vmax
O valor de Km indica a afinidade da enzima pelo substrato: quanto menor Km, maior a afinidade. Vmax indica a velocidade máxima de formação de produto em condições de saturação de substrato V é igual a velocidade máxima quando [S]100Km ( cinética de ordem zero)

15 Efeito da concentração de substrato na velocidade da reação, considerando-se concentração de enzima fixa Com concentração fixa de enzima, de início temos um rápido aumento na velocidade de reação. A medida que a concentração do substrato continua a crescer, o aumento na velocidade da reação começa a diminuir até que, com grande concentração de substrato, não se observa aumento da velocidade de reação.

16 Velocidades de reação enzimática com diferentes concentrações de substrato
vo3 vo2 vo1 4

17 Efeito da concentração da enzima
A velocidade de uma reação enzimática depende diretamente da concentração da enzima, na presença de excesso de substrato. Gráficos Mostrar software bioquímica

18 Velocidades de reação enzimática com diferentes concentrações de enzima
Tempo [P]

19 Outra classificação das enzimas
Enzimas Monoméricas: Possuem apenas uma cadeia polipeptídica, no qual se situa o sítio Ativo. Enzima PM Resíduos de a a Lizosima (clara de ovo) 14600 129 Papaína (protease de mamão) 13700 124 Tripsina (protease pancreática 23800 203

20 Classificação das enzimas
2. Enzimas Oligoméricas: Contém no mínimo 2 ou até 60 subunidades firmemente associadas para formar a enzima ativa Enzima Subunidades Número PM PM da Enzima Fosforilase 4 92500 370000 Hexoquinase 27500 102000 Fosfofruto quinase 2 78000 190000

21 Complexo Multienzimático
Enzimas que estão fortemente associadas e estão envolvidas em uma série sequencial de reações. Qualquer tentativa de dissociar as enzimas resulta em inativação. Exemplos: Complexo piruvato desidrogenase (metabolismo de carboidratos) Complexo -cetoglutarato desidrogenase (Ciclo de Krebs) Complexo ácido graxo sintetase (biossíntese de ácido graxos)

22 Classificação de enzimas
3. Isoenzimas: Têm múltiplas formas moleculares no mesmo organismo e catalisam a mesma reação. Ác. Pirúvico Ác. Láctico Lactato desidrogenase

23 Conversão de Zimogênios em enzimas ativas
Agente ativador Enzima Pepsinogênio H+ ou pepsina pepsina Tripsinogênio Enteroquinase ou tripsina tripsina Quimotripsinogenio A Alfa quimotripsina Proelastase elastase

24 Cofatores Moléculas ou íons que se associam a algumas enzimas para promover atividade catalítica: Coenzimas: cofator orgânico Enzima + cofator = Grupo prostético Enzima + grupo prostético = Holoenzima

25 Cofatores São compostos que são necessários para a enzima catalisar a reação Podem ser classificados em: Íons metálicos Coenzimas Grupos protéticos

26 Íons metálicos Grande número de enzimas exigem cátions mono ou divalentes (K+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Zn2+) como ativadores metálicos. Esses íons podem estar presos à porção protéica forte ou fracamente, através da formação de quelatos com grupos fenólicos, amino, fosfato ou carbonilo

27 Íons Metálicos Enzimas que contém íons metálicos, presentes em frutas e vegetais, que causam deteriorações oxidativas Enzima Íon Ação da Enzima Peroxidase Fe3+ Ação deteriorativa em frutas e vegetais, formação de sabor e aromas estranhos Polifenoloxidase Cu2+ Escurecimento enzimático em frutas e vegetais Ácido ascórbico Oxidase Oxidação da Vit. C Catalase Decomposição de peróxido de hidrogênio

28 Coenzimas Coenzima: Molécula orgânica pequena, termoestável que se dissocia facilmente da proteína enzimática Pode ser separada por diálise Ex. CH3CH2OH + NAD CH3CHO+NADH+H+

29 Grupo prostético Cofator firmemente ligado à proteína enzimática e não pode ser separado sem destruir a enzima Exemplo: FAD+ (Flavina adenina dinucleotídeo)

30 Especificidade Enzimática
A especificidade permite modificar seletivamente compostos individuais dos alimentos sem afetar outros. Amido Amido liquefeito (glicose,maltose, maltotriose,-limite dextrina) Proteína Peptídeos, aminoácidos Triglicerídeos Diglicerídeos+monoglicerídeos ácidos graxos -amilase Protease Lipase pancreática 1,3 específica

31 Especificidade Enzimática
A especificidade torna as enzimas importantes como um instrumento analítico. Determinação Enzimática de Glicose Glicose Ácido glucônico + H2O2 2H2O2 + o-dianizidina+peroxidase Complexo colorido (Vermelho-Marrom)(450nm) Glicose Oxidase

32 Enzimas A especificidade das enzimas distingue-as dos catalisadores não biológicos Mistura de 500g de glicose 500g de frutose 500g de galactose por mL de amostra Arseniato de sódio+ Molibdato de amônio+ H2SO4( SN II) CuSO4 em meio alcalino (SN I)  1500g açúcares redutores/ mL amostra

33 Determinação Enzimática
Glicose oxidase reage especificamente com glicose Mistura de 500g de glicose 500g de frutose 500g de galactose por mL de amostra Determinação Enzimática de Glicose 500g de glicose/mL de amostra (Kit glicose oxidase)

34 Especificidade das enzimas
Especificidade de Grupo: Uma enzima pode apresentar especificidade de grupo, ou seja, um grupo de compostos pode servir como substrato Ex: Glicose + ATP Glicose-6P Frutose + ATP Frutose-6P Manose + ATP Manose-6P Hexoquinase Hexoquinase Hexoquinase

35 Especificidade absoluta
A enzima atua sobre um único substrato e catalisa uma única reação Ex: R-arginina-glicina-R R-arginina + glicina-R (fibrina+2 peptídeos) Trombina Fibrinogênio

36 Baixa especificidade A enzima não discrimina o substrato e exibe somente especificidade em relação a ligação a ser rompida Caseína Peptídeos+Aminoácidos Miosina e Actina Peptídeos+Aminoácidos Pepsina(protease do estômago) (Proteína do Leite) Pepsina(protease do estômago) (Proteínas da Carne)

37 Especificidade Esteroquímica esteroespecificidade
Muitas enzimas apresentam esteroespecificidade por um isômero óptico ou geométrico em particular L-aminoácidos -cetoácidos+NH3+H2O2 D-aminoácidos -cetoácidos+NH3+H2O2 L-aminoácido oxidase D-aminoácido oxidase

38 Unidade de Atividade Enzimática
De acordo com a regra internacional, uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima que causa a transformação de 1,0 mol de substrato por minuto a 25ºC sob condições ótimas de ensaio. Atividade: Refere-se ao total de unidades de enzimas em uma solução Atividade específica: É o número de unidades de enzima por miligrama de proteína

39 Atividade Específica A atividade específica é uma medida da pureza da enzima: aumenta durante as etapas de purificação de uma enzima e se torna máxima ou constante quando a enzima está pura.