Pós-Graduação em Genética

Apresentação em tema: "Pós-Graduação em Genética"— Transcrição da apresentação:

1 Pós-Graduação em Genética
Técnicas Citoquímicas aplicadas às alterações biológicas em resposta a agressões ambientais Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise Docente: Profa Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira Aluna: Maria Isabel Afonso da Silva

2 A ordem Chelonia: muitas particularidades características peculiares Poucas referências bibliográficas M.a. de evolução e adaptações

3 intensa exploração e urbanização
INTRODUÇÃO Crescente expansão das fronteiras agrícolas e industriais intensa exploração e urbanização contaminam os habitats dos animais silvestres Comprometer a sobrevivência e fisiologia dos organismos; Induzir alterações genéticas Mutações e/ou Carcinogênese.

4 Phrynops geoffroanus ou “Cágado-de-Barbelas”
INTRODUÇÃO Phrynops geoffroanus ou “Cágado-de-Barbelas” Ampla distribuição na América do Sul

5 Características fisiológicas Influências ambientais
INTRODUÇÃO Perfil hematológico Perfil fisiológico Biologia da espécie Preservação Manejo adequado Características fisiológicas Influências ambientais Hematologia de répteis

6 O perfil hematológico de répteis pode sofrer grande variação fisiológica;
A interpretação dos achados da série branca é distinta e complexa É necessário elaborar um perfil para a espécie em estudo em determinada região e situação através de pesquisas periódicas. Estudos em relação a diversas condições ambientais => hábitos de vida e adaptações ao ambiente, futura comparação com outras espécies para maior compreensão dos aspectos evolutivos e conhecimento sobre esta.

7 Amostras Sanguíneas Punção Cardíaca

8 Dosagem da hemoglobina circulante Contagem de células
1- Hemograma Hematócrito Dosagem da hemoglobina circulante Contagem de células Contagem de eritrócitos Cálculo de leucócitos Cálculo dos índices hematimétricos VGM CHGM HGM Contagem diferencial dos leucócitos

9 Panótipo (Hematocor-BiológicaR)
Reação de Acidofilia/Basofilia -Mediadas por Ligações Eletrostáticas Coloração de rotina para análise geral da morfologia das células sanguíneas Facilita a identificação e diferenciação dos leucócitos Basofilia: Corantes básicos (+)/ catiônico Substrato aniônico (-) Como a hematoxilina - grupamentos fosfatos dos ácidos nucléicos (Núcleo) Como a eosina Amino de resíduos protéicos (NH3)- (núcleo e Citoplasma) Acidofilia: Corantes ácidos (-)/ aniônico Substrato catiônico (+)

10 Células Vermelhas de Quelônios
Atuam na inflamação, promovem fagocitose; como célula hemostática

11 Células brancas de Quelônios
Requisitados no combate a doenças infecciosas de origem bacterianas infecção viral, Respondem à infecções bacterianas

12 Células Brancas de Quelônios
Encontrados em infecções parasitárias. Estão presentes no combate a infecções bacterianas. reações imunes.

13 Citoquímica de Enzimas
proteínas de forma tridimensional  acelerar as reações químicas  são catalisadores biológicos. O resultado da reação é uma mudança específica do substrato, criando uma nova molécula química ou um produto.

14 As enzimas são classificadas de acordo com o tipo de reação química que realizam.
Copyright ©2002 BMJ Publishing Group Ltd. habilidade de catalisar, em condições ácidas, a hidrólise de monoesteres ortofosfato Podem ser diferenciadas de acordo com propriedades estruturais, catalíticas, imunológicas, distribuição no tecido e localização subcelular

15 Fosfatases ácidas Encontradas em eritrócitos, leucócitos, fígado, baço, rins, ossos e outros tecidos em humanos Em répteis não se tem muito estudo sobre sua localização. A LAP => monoester ortofosfórico do compartimento endossomo/lisossomo fundamental para o catabolismo de um ou vários substratos no lisossomo. Muitas doenças lisossomais => manifestações morfológicas, bioquímicas e clínicas causadas pelo armazenamento do conteúdo lisossômico.

16 Fosfatases ácidas Responsáveis pela hidrólise dos fosfatos de ésteres orgânicos, que durante a incubação cria a base para as reações citoquímicas. Especificidade por substrato menos limitada Ótima atividade em valores baixos de pH. Localização: Lisossomos, complexo de Golgi, corpos multivesiculares superfície do RER hidrolizam uma variedade de ésteres orgânicos com a liberação de íons fosfatos. Seu papel é muito importante na autólise de tecidos

17 Fosfatases ácidas Método de fosfato de chumbo - Gömöri (1950)
-glicerofosfato de sódio + Nitrato de Chumbo (com tampão acetato). 37ºC por 30’ enzimas liberam o fosfato do substrato precipitado insolúvel de fosfato de chumbo lavar em Tampão Acetato (pH 5,0) e mergulhar em sulfeto de amônia 1%, 1’ sulfeto de chumbo depósito granular denso e escuro, com coloração marrom. Como controle, é utilizado meio de incubação sem o substrato Observações: O meio de incubação é preparado no dia anterior e permanece over-night a 37º C; os reagentes são guardados em solução estoque a 4ºC. O pH da solução de incubação final é importante e não pode exceder 5,2. A solução de sulfeto de amônia a 1% é preparada no momento de uso.

18 relacionada com a destruição da matriz óssea pela ação de enzimas, com a reabsorção de tecido ósseo.

19 Peroxidases doador POD: fazem parte do grupo das enzimas oxidases.
catalisar a transferência H peróxido de hidrogênio Variações nos padrões dos sistemas isoenzimáticos da peroxidase => organismos submetidas a estresses abióticos. O incremento da atividade dessas enzimas antioxidantes é fundamental para evitar danos em nível celular. peroxidases peróxido de hidrogênio decomposto pela oxidação de cosubstratos (compostos fenólicos e/ou antioxidantes) Organismos com altos níveis de antioxidantes => mais tolerantes a danos oxidativos

20 Método=> Sato (1928), segundo Lison (1960).
Peroxidases É incapaz de funcionar anaerobicamente e precisam de peróxido como catalizador. Método=> Sato (1928), segundo Lison (1960). benzidina (incolor e insolúvel) Peroxidases:catalítico para H2O2 oxida benzopurpurina (cor marrom avermelhado) azul de benzidina (instável e insolúvel)

21 Peroxidases 1) Solução: sulfato de cobre e ácido acético durante 1’. 2)Lavar com água destilada. 3)Cobrir com uma solução saturada de benzidina + H2O2 (10 V) –homogeneizar- 2 a 8 minutos. Como controle da reação=> dois meios, um na ausência de benzidina e outro sem peróxido de hidrogênio. 4)Lavar novamente e cobrir com solução aquosa de fucsina básica a 1% durante 20 segundos. O material, após novamente ser lavado em água destilada, é seco ao ar e montado em gelatina-glicerina

22 Método citoquímico de peroxidase em amostras de sangue humano
Método citoquímico de peroxidase em amostras de sangue humano. À esquerda- atividade de peroxidase positiva em neutrófilo. A amostra à direita corresponde ao controle da reação.

23 Os métodos + comumente usados para avaliar genotoxicidade e danos citotóxicos => contagem de MN e fragmentação de DNA - detectados em diferentes tipos de células pelo ensaio cometa Mutagênicos: agem sobre o desenvolvimento=> redução no índice mitótico => comprometimento no desenv. e cresc. do organismo. impacto significativo sobre o “pool” gênico de uma população Alterações citogenéticas específicas x teratogênese Genotóxicos: defeitos hereditários -mutações em células germinativas efeitos teratogênicos mutações pontuais, deleções, translocações e aneuploidia; quebra da dupla fita de DNA, aberrações cromossômicas, formação de micronúcleo, intercâmbio de cromátides irmãs.

24 Os micronúcleos: originam-se de
fragmentos cromossômicos acêntricos cromossomos com atraso durante a anáfase originam-se de dispersos no citoplasma – separados do núcleo principal. Aparência: pequeno núcleo MO: material nuclear, intensidade luminosa ~ núcleo, formato oval/circular A< 1/3 do núcleo

25 Os micronúcleos: formados durante a telófase
representam a perda de cromatina cromossômico estrutural dano no aparelho mitótico

26 Teste do micronúcleo: desenvolvido por Schmid (1975)
avaliar genotoxicidade e danos citotóxicos. detecta mutações brutas: aberrações cromossômicas Utilizações: monitoramento biológico e ambiental rastreio de compostos para determinar a sua genotoxicidade após exposição direta ou indireta avaliações toxicológicas dos produtos químicos industriais avaliações dos perigos de exposição geral.

27 Teste do micronúcleo: Esfregaços: 1. Fixar 10’ em metanol absoluto
2. Após 24 horas=> em HCl à 60O C por 11’ 3. Reativo de Schiff por 2 horas, em local escuro. 4. “Fast Green” por 20 segundos.

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29 Teste do micronúcleo: Vantagens: acessível, não-invasivo
análise rápida de um elevado número de células a velocidade e facilidade de análise, não-exigência de células em metáfase, pequenas concentrações de células eficácia em danos clastogênicos e aneugênicos.

30 Ensaio Cometa Outra técnica útil para biomonitoramento de contaminação ambiental. Processo rápido, simples e sensível => vários tipos de células Possibilidade de medir a integridade do DNA em nível celular. Pode detectar baixos níveis de danos de DNA Exige um pequeno número de células por amostra, Flexível Curto período de tempo necessário para concluir um estudo

31 Ensaio Cometa Células com danos no DNA produzem aumento da migração de fragmentos de DNA do núcleo "cauda de cometa". A visualização de mobilidade dos fragmentos de DNA => modo conveniente e sensível de detectar quebra de DNA nas células. O nível de base de danos no DNA varia => espécie x tipo de células; isto influenciará a sensibilidade do ensaio Agentes endógenos/ produtos do metabolismo celular aeróbio e inflamação + exógenos/ uma variedade de agentes químicos e físicos modificar o DNA celular e outros componentes celulares.

32 20’ em geladeira cobertas com lamínulas.
Ostling e Johanson em 1984 Singh et al. (1988) e Klaude et al. (1996) sangue coletado é diluído em solução fisiológica Depositar 10 L da suspensão celular preparada com 120 L de agarose de baixo ponto de fusão a 37º C sobre lâminas pré-gelatinizadas. 20’ em geladeira cobertas com lamínulas. solução de lise - 1h tampão NaOH com EDTA (pH ~13), por 20 minutos em corrente de eletroforese, no escuro neutralizadas com Tris, por 15 minutos e fixadas em etanol absoluto por 10 minutos.

33 A análise => microscópio de fluorescência, em objetiva de 40x.

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35 Técnicas de micronúcleo, cometa
CONCLUSÃO Há grande impacto dos poluentes do ambiente sobre o organismo em estudo. Técnicas de micronúcleo, cometa Ferramentas de biomonitoração das regiões naturais Avaliação de agentes genotóxicos e mutagênicos Phrynops geoffroanus como um organismo sentinela de efeitos genotóxicos. Os dados úteis para futuros estudos que envolvam a biomonitorização das regiões naturais

36 OBRIGADA!!!