Diagnóstico e classificação das neoplasias hematológicas

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1 Diagnóstico e classificação das neoplasias hematológicas
UNICAMP Diagnóstico e classificação das neoplasias hematológicas Diagnóstico das neoplasias hematológicas Erich Vinicius de Paula Divisão de Hemoterapia Hemocentro da Unicamp

2 Neoplasias Hematológicas (NH)
Definição de neoplasia Características do tecido com transformação maligna Leucemia Aguda x Crônica Hiato leucêmico Sd. Linfoproliferativa Benignas x Malignas Agudas x crônicas Linfomas Neoplasia = novo crescimento Definição do eminente ocologista Sir Rupert Willis (1952): “Uma neoplasia é uma massa anormal de tecido cujo crescimento excede em tamanho e é descoordenado ao do tecido normal correspondente, além de persistir mesmo após cessado o estímulo que desencadeou seu crescimento.” Podemos acrescentar que a massa não tem função biológica, tem crescimento autônomo, e cresce às custas do hospedeiro, na medida em que compete em espaço e energia com os tecidos normais do hospedeiro.

3 Quadro clínico das NH Falência medular
Anemia Febre e infecções Hemorragias Infiltração de outros tecidos: linfonodos, pele, gengiva, ossos, SNC, etc

4 Falência Medular Hemorragias Herpes Zoster

5 Linfonodomegalia

6 Linfonodomegalia mediastinal

7 Esplenomegalia

8 Infiltração gengival

9 Hematopoiese normal

10 Célula progenitora linfóide
Linfócito T Célula progenitora linfóide LPC Linfócito B Megacariócito CFU-Meg Célula tronco linhagem-específica CSC Plaquetas PSC Célula tronco pluripotente BFU-E CFU-E Hem CFU-E Célula progenitora mielóide MPC Monócitos CFU-M CFU-M CFU-G Neutrófilos CFU-GM CFU-G CFU-GM CFU-Eo Eosinófilos CFU-Eo CFU-Mast Basófilos CFU-Mast

11 Fatores de crescimento
Linfócito T Célula progenitora linfóide LPC IL-2 Linfócito B Megacariócito Célula tronco linhagem-específica CFU-Meg TPO CSC Plaquetas PSC Célula tronco pluripotente IL-1 SCF BFU-E EPO CFU-E * Hem CFU-E Célula progenitora mielóide MPC M-CSF Monócitos CFU-M * CFU-M * * IL-3 GM-CSF G-CSF CFU-G Neutrófilos CFU-GM * CFU-G CFU-GM IL-6 CFU-Eo Eosinófilos CFU-Eo Fatores de crescimento hematopoiéticos IL-3 CFU-Mast Basófilos CFU-Mast

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14 Leucemogênese

15 MO normal Leucemia aguda

16 Proliferação Células T Células B Monócitos Neutrófilos Eritrócitos
Plaquetas Células B Monócitos Proliferação

17 Diferenciação Células T Células B Monócitos Neutrófilos Eritrócitos
Plaquetas Células B Monócitos Diferenciação

18 Perda do controle proliferativo
Células T Neutrófilos Eritrócitos Plaquetas Células B Monócitos Perda do controle proliferativo

19 Perda do controle proliferativo
Células T Neutrófilos Eritrócitos Plaquetas Células B Monócitos Perda do controle proliferativo

20 Bloqueio da diferenciação
Células T Neutrófilos Eritrócitos Plaquetas Células B Monócitos Bloqueio da diferenciação Auto-renovação

21 Fisiopatogênese da NH Várias aberrações cromossômicas foram detectadas em leucemias, as quais se correlacionam com o quadro clinico de cada subtipo de leucemia. A maioria dos pontos de quebra destas translocações já foram clonados molecularmente, de modo que hoje é possível um diagnóstico molecular da maioria dos pacientes com leucemia. Além disso, a partir do conhecimento destas translocações foi possível compreender melhor a fisiopatologia de alguns subtipos e em alguns casos, se chegar a tratamentos cujo alvo são precisamente as alterações detectadas.

22 Leucemias mielóides Translocações do CBF Leucemias mielóides
Translocações do Core Binding Factor (CBF): t(8,21) é achada em 20% dos pacientes com LMA, e está associada ao subtipo M2. O gene identificado no ponto de quebra da translocação é o AML1, também chamado de CBFalfa. Ele também está envolvido em outras translocações achadas em mielodisplasias, crise blástica da LMC e LLA, todas envolvendo o cromossomo 21. AML1 codifica uma parte de um fator de transcrição conhecido como CBF. O sítio de ligação para este fator está presente em genes como o receptor de células T, mieloperoxidase e elastase neutrofílica, e de citocinas como GM-CSF e IL-3. Assim, a função deste fator deve ser orquestrar o processo de diferenciação de células da linhagem linfóide e mielóide. De fato, KO do AML1 não completa desenvolvimento por falha na hemopoiese. O que ocorre nas translocações ? No caso da t(8,21), forma-se uma proteína de fusão com os genes AML1 e ETO (cromossomo 8). Esta proteína perde um sítio importante de ativação do CBF, inibindo a função deste fator (tentar colocar diagrama) Outra translocação recorrente associada à LMA M4 com eosinofilia Curiosamente, também interfere na ação do CBF, só que desta vez na subunidade beta sem a qual o CBF não funciona corretamente. Na inv(16), a subunidade beta fica intacta mas sua porção C-terminal se funde com o gene da cadeia pesada da miosina do músculo liso, criando uma proteína de fusão muitas vezes maior que a proteína nativa. Esta proteína mantém a capacidade de se ligar ao AML1, mas provavelmente pelo seu tamanho interfere na função do AML1. Aspectos terapêuticos: restauração da atividade da AML1... Nada ainda

23 Leucemias mielóides Translocações do CBF inv (16)

24 Leucemias mielóides Translocações do receptor do ácido retinóico
A associação da t (15,17) com leucemia promielocítica é conhecida há anos mas só recentemente os mecanismos moleculares foram esclarecidos A ligação entre a descoberta do fenótipo molecular da LMA M3 e de sua sensibilidade ao Ácido all-trans retinoico (ATRA) representa um dos maiores sucessos na interação entre a biologia molecular e a prática médica. O ATRA é um agente indutor de diferenciação em várias linhagens celulares. Em 1988 um grupo de pesquisadores chineses descreveu resposta clínica ao ATRA em pacientes com LMA M3. Pouco tempo depois, três grupos descobriram que a t(15,17) leva a um rearranjo genético que envolve o receptor do ácido retinoico (RARalfa) t(15,17) funde o RARalfa com o gene PML, que codifica proteínas que se localizam em organelas nucleares específicas chamadas PODs (multi-protein nuclear bodies). A função do PML e dos POds é desconhecida, mas o que se sabe é que a proteína PML/RARalfa altera a arquitetura dos PODs. O que se imagina é que o PML/RARalfa atue como inibidor da diferenciação induzida pelo ácido retinoico por atrapalhar a ligação de uma proteína fundamental a este processo, a qual normalmente se ligaria ao receptor do ácido retinoico. Ou ainda por atrapalhar a função dos PODs. O importante é que o uso do ATRA restaura ambas as fu~ções e induz a diferenciação das células leucêmicas. Outras translocações podem estar presentes como a 11,17 e a 5,17. Em ambas se formam proteínas de fusão o gene RARalfa. t (15,17)

25 Leucemias mielóides Translocações de tirosina quinases
Translocações em tirosina-quinases t (9,22): esta foi o primeiro marcador citogenético de um tumor humano identificado e é conhecido como o cromossomo filadélfia. A identificação levou à clonagem da proteína de fusão BCR/ABL em 1988. A porção N terminal do BCR está fundida com o gene ABL completo, levando a uma proteína de 210kDa. O gene ABL já era conhecido desde 1980 como um oncogene que codifica uma tirosina-quinase, presente no genoma do Abelson murine leukemia retrovirus, o que levou imediatamente à suspeita de seu envolvimento na fisiopatologia da leucemogênese. De fato, a hipótese de que o BCR/ABL levaria à ativação constitutiva de uma tirosina quinase citoplasmática que induz a ativação de várias vias de sinalização cujo resultado final são a mitogênese e o crescimento celular foi confirmada. BCR/ABL pode estimular o crescimento de células hematopoiéticas cuja proliferação é dependente de fatores de crescimento em meio com concentrações mínimas ou nulas destes fatores, o que pode explicar o acúmulo de células hematopoiéticas na LMC. As vias envolvidas já identificadas são as do RAS e do STAT, que são ativadas por fatores de transcrição como o EGF. Outras translocações recorrentes levam à geração de proteínas de fusão que agem por induzirem a ativação constitutiva de tirposina quinases incluem a TEL/PDGRFbeta e o TEL/ABL.

26 Faderl S (1999) NEJM 341:164-72

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29 Linfomas Linfomas foliculares: t (14,18) Burkitt: t (8,14)
Mutações do p53 Linfomas foliculares: t (14,18) está presente em 80 a 90% dos linfomas foliculares. Esta translocação leva à justaposição do gene chamado BCL2 ao gene da cadeia pesada da imunoglobulina. A proteína BCL-2 está normalmente expressa durante a diferenciação da linhagem de linfócitos B e sua expressão tende a cair durante a proliferação . Vários estudos já demonstraram que ela é um inibidor da apoptose. A hiperexpressão da BCL-2 desta forma gera uma vantagem proliferativa para os clones envolvidos que por si só não é suficiente para transformação maligna, mas permite que novas mutações ocorram facilitando a linfomagênese, entre elas a ativação do oncongene cMYC que leva a uma quadro de linfoma mais agressivo Burkitt: cmyc. A t (8,14) está presente em 75% dos linfomas de Burkitt, e leva à justaposição gene do fator de transcrição cMYC ao gene da cadeia pesada de imunoglobulina. Nos outros casos se acham outras translocações envolvendo o cMYC, cujo fato comum é que a região codificadora deste fator é conservada intacta. Em todos os casos, esta justaposição leva à hiperexpressão do cMYC. Vários estudos já demosntraram que o cMYC é um oncogene capaz de promover a progressão do ciclo celular e induzir a transformação maligna, vencendo mecanismos normais de controle da progressão das células ao longo do ciclo celular. p53: as mutações da proteína p53, localizada no cromossomo 17 são as mais comumente encontradas em tumores humanos e também são muito importantes em linfomas. Esta proteína, já chamada de “guardiã do genoma” monitoriza os mecanismos de reparo do DNA garantindo que este seja completado antes da progressão do ciclo celular. Ela mantém as células em G1 até que este reparo esteja completo. Além disso, caso este reparo não seja possível, ela é capaz de induzir apoptose.

30 Modalidades diagnósticas para as neoplasias hematológicas
Morfologia Citoquímica Histoquímica Imunohisto ou imunocitoquímica Citometria de fluxo (Imunofenotipagem) Citogenética clássica FISH Biologia molecular Diagnóstico laboratorial envolve critérios morfológicos (histologia de medula e outros tecidos, citologia de sangue periférico, aspirados de medula óssea, linfonodos ou líquidos biológicos) Imunohistoquímica (MO e outros tecidos) Citioquímica (MO e sangue periférico) Citogenética (MO, sangue periférico) Imunofenotipagem (MO, sangue periférico, aspirados de linfonodos) Técnicas de biologia molecular FISH

31 Classificação Franco-Americana-Britânica (FAB)
Morfológica FAB e WHO Bennet JM et al. (1976), Br J Haematol, 33:451-9

32 Classificação da Organização Mundial da Saúde
Critérios diversos Harris NL et al. (1999), J Clin Oncol, 17:3835-9

33 Significado clínicos das alterações cromossômicas

34 Colorações citoquímicas usadas no diagnóstico e classificação das leucemias

35 Características Morfológicas

36 Benigno x Maligno Série branca normal (sp)

37 Linfócito maduro e linfócito ativado (sp)
Linfócitos ativados (inf. Viral) (sp) Mieloblastos em medula normal Linfócitos atípicos na mononucleose (sp)

38 (a) Mieloblasto (MO) (b-d) Linfócitos imaturos (sp)

39 Leucemia Mielóide Crônica

40 LMA M2 – Leucemia aguda com maturação granulocítica
MO

41 LMA M3 Blastos de LMA M3 (sp) Bastonetes de Auer (MO)
Peroxidase fortemente positiva em LMA M3 (MO)

42 LMA M4 Mielomonocítica Blastos de LMA M4 (sp) Peroxidase (MO)
Esterase inespecífica (MO)

43 LMA M5 - Monocítica - Monoblástica
Blastos em sp

44 LMA M5 Peroxidase (MO) Esterase inespecífica (MO)

45 LMA M6 Eritroleucemia Medula óssea Medula óssea

46 LMA M7 LMA M7 (sp) GpIIb/IIIa LMA M7 (MO) FvW

47 Leucemia Linfoblástica Aguda Linfoblastos (sp) Peroxidase (MO)

48 Leucemia linfocítica crônica
LLC sp Sangue periférico sp

49 Citometria de fluxo

50 Paciente com 64 anos. Procurou serviço médico devido a lesão purulenta em face (furúnculo). Há 3 meses apresentando cansaço discreto e hematomas em sítios de trauma LMA M1: fortemente positiva para HLA-DR, CD13, CD34, CD38.

51 Paciente com 49 anos, com confusão e desorientação, apresentando sangramento em SNC. Laboratorialmente, pancitopenia e prolongamento de TP e TTPa, e hipofibrinogenemia. Realizado punção de medula óssea LMA M3 positiva para CD33, CD13, CD34. Negativa para HLA-DR

52 Paciente com 6 anos com cansaço progressivo há 2 semanas, evoluindo com dor contínua em região dorsal. Ao exame apresentava petéquias e palidez. Realizado hemograma LLA pré-B comum. Positiva para CD19, CD10, CD34, HLA-DR

53 Paciente de 15 anos, apresentando dificuldade respiratória durante os exercícios da educação física. Raio X de tórax revelou massa mediastinal. Ao hemograma, anemia e grnade leucocitose às custas de blastos de pequeno tamanho com citoplasma escasso e agranular. LLA-T positiva para CD5, CD3, CD34, CD10. Positiivade parcial para CD4 e CD8

54 Paciente com 70 anos sem queixas
Paciente com 70 anos sem queixas. Hemograma de rotina mostrou: Hb=14,0g% Plaquetas= /ul e leucócitos = /ul com 96% de linfócitos maduros LLC-B com restrição de cadeia Kappa

55 Paciente de 60 anos evoluindo com linfonodomegalia cervical há 2 meses
Paciente de 60 anos evoluindo com linfonodomegalia cervical há 2 meses. Ao exame, linfonodomegalia cervical bilateral, inguinal, além de hepatoesplenomegalia. Ao hemograma leucocitose às custas de linfócitos com citoplasma abundante, núcleos convolutos e alguns nucléolos evidentes LNH células do manto. Co-expressão de CD5 e CD20. CD23 negativo. Restrição para cadeia Lambda

56 Perspectivas Futuras

57 Estudos de expressão gênica em NH

58 Desenvolvimento de drogas direcionadas
ao defeito molecular Goldman J (2001). NEJM 344:

59 Conclusões Aspectos morfológicos são fundamentais ao diagnóstico e à classificação das NH Atualmente a classificação das NH envolve outras modalidades diagnósticas O conhecimento da fisiopatogenia das NH vem levando a importantes avanços no diagnóstico e no tratamento destas doenças